Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Toxoplasma gondii huwa parassita protożoan intraċellulari li jimmodula l-mikroambjent tal-ospitant infettat u huwa magħruf li huwa assoċjat mal-inċidenza tat-tkabbir tat-tumur tal-moħħ.F'dan l-istudju, aħna ipoteżi li exosomal miRNA-21 minn infezzjoni Toxoplasma jippromwovi t-tkabbir tat-tumur tal-moħħ.Eżosomi minn mikroglia BV2 infettati b'Toxoplasma ġew ikkaratterizzati u l-internalizzazzjoni taċ-ċelloli tal-glijoma U87 ġiet ikkonfermata.Profili ta 'espressjoni ta' microRNA exosomal ġew analizzati bl-użu ta 'arrays ta' microRNA u microRNA-21A-5p assoċjati ma 'Toxoplasma gondii u għażla tat-tumur.Aħna investigajna wkoll il-livelli ta 'mRNA ta' ġeni assoċjati mat-tumur fiċ-ċelloli tal-glijoma U87 billi nbiddlu l-livelli ta 'miR-21 fl-eżosomi u l-effett tal-eżosomi fuq il-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-glioma U87 tal-bniedem.F'exosomes ta 'ċelluli glijoma U87 infettati b'Toxoplasma gondii, l-espressjoni ta' microRNA-21 tiżdied u l-attività tal-ġeni antitumorali (FoxO1, PTEN, u PDCD4) titnaqqas.Exosomes derivati ​​minn BV2 infettati b'Toxoplasma jinduċu proliferazzjoni ta 'ċelluli glijoma U87.Exosomes jinduċu tkabbir ta 'ċelluli U87 f'mudell ta' tumur tal-ġrieden.Nissuġġerixxu li ż-żieda ta 'miR-21 exosomal fil-mikroglia BV2 infettata b'Toxoplasma jista' jkollha rwol importanti bħala promotur tat-tkabbir taċ-ċelluli fiċ-ċelloli tal-glijoma U87 billi jirregola ġeni antitumorali.
Huwa stmat li aktar minn 18.1 miljun każ ta’ kanċer avvanzat ġew iddijanjostikati madwar id-dinja fl-2018, b’madwar 297,000 tumuri tas-sistema nervuża ċentrali dijanjostikati kull sena (1.6% tat-tumuri kollha)1.Riċerka preċedenti wriet li fatturi ta 'riskju għall-iżvilupp ta' tumuri fil-moħħ tal-bniedem jinkludu diversi prodotti kimiċi, storja tal-familja, u radjazzjoni jonizzanti minn tagħmir terapewtiku u dijanjostiku tar-ras.Madankollu, il-kawża eżatta ta’ dawn il-tumuri malinni mhix magħrufa.Madwar 20% tal-kanċers kollha madwar id-dinja huma kkawżati minn aġenti infettivi, inklużi viruses, batterji u parassiti3,4.Patoġeni infettivi jfixklu l-mekkaniżmi ġenetiċi taċ-ċellula ospitanti, bħat-tiswija tad-DNA u ċ-ċiklu taċ-ċelluli, u jistgħu jwasslu għal infjammazzjoni kronika u ħsara lis-sistema immuni5.
L-aġenti infettivi assoċjati mal-kanċer tal-bniedem huma l-aktar patoġeni virali komuni, inklużi l-papillomaviruses tal-bniedem u l-viruses tal-epatite B u C.Il-parassiti jistgħu wkoll ikollhom rwol potenzjali fl-iżvilupp tal-kanċer tal-bniedem.Diversi speċi ta 'parassiti, jiġifieri Schistosoma, Opishorchis viverrini, O. felineus, Clonorchis sinensis u Hymenolepis nana, ġew implikati f'diversi tipi ta' kanċer uman 6,7,8.
Toxoplasma gondii huwa protożoan intraċellulari li jirregola l-mikroambjent taċ-ċelluli ospitanti infettati.Huwa stmat li dan il-parassita jinfetta madwar 30% tal-popolazzjoni tad-dinja, u jpoġġi lill-popolazzjoni kollha f'riskju9,10.Toxoplasma gondii jista’ jinfetta organi vitali, inkluż is-sistema nervuża ċentrali (CNS), u jikkawża mard serju bħal meninġite fatali u enċefalite, speċjalment f’pazjenti immunokompromessi9.Madankollu, Toxoplasma gondii jista 'wkoll ibiddel l-ambjent tal-ospitant infettat billi jimmodula t-tkabbir taċ-ċelluli u r-risponsi immuni f'individwi immunokompetenti, li jwassal għaż-żamma ta' infezzjoni kronika mingħajr sintomi9,11.Interessanti, minħabba l-korrelazzjoni bejn il-prevalenza ta 'T. gondii u l-inċidenza tat-tumur tal-moħħ, xi rapporti jissuġġerixxu li bidliet ambjentali ospitanti in vivo minħabba infezzjoni kronika ta' T. gondii jixbħu l-mikroambjent tat-tumur.
L-eżosomi huma magħrufa bħala komunikaturi interċellulari li jwasslu kontenut bijoloġiku, inklużi proteini u aċidi nuklejċi, minn ċelloli ġirien16,17.Exosomes jistgħu jinfluwenzaw proċessi bijoloġiċi relatati mat-tumur bħal anti-apoptosis, anġjoġenesi, u metastasi fil-mikroambjent tat-tumur.B'mod partikolari, miRNAs (miRNAs), RNAs żgħar li ma jikkodifikawx madwar 22 nukleotide fit-tul, huma regolaturi importanti tal-ġeni ta 'wara t-traskrizzjoni li jikkontrollaw aktar minn 30% tal-mRNA uman permezz tal-kumpless tas-sajlenser indott mill-miRNA (miRISC).Toxoplasma gondii jista' jfixkel il-proċessi bijoloġiċi billi jikkontrolla l-espressjoni ta' miRNA f'ospiti infettati.Il-miRNAs ospitanti fihom sinjali importanti għar-regolazzjoni tal-proċessi bijoloġiċi ospitanti biex tinkiseb l-istrateġija ta 'sopravivenza tal-parassita.Għalhekk, l-istudju tal-bidliet fil-profil tal-miRNA ospitanti wara infezzjoni b'T. gondii jista' jgħinna nifhmu l-interazzjoni bejn l-ospitant u T. gondii b'mod aktar ċar.Tabilħaqq, Thirugnanam et al.15 issuġġerixxa li T. gondii jippromwovi karċinoġenesi tal-moħħ billi jbiddel l-espressjoni tiegħu fuq miRNAs ospitanti speċifiċi assoċjati mat-tkabbir tat-tumur u sab li T. gondii jista 'jikkawża glijomi f'annimali sperimentali.
Dan l-istudju jiffoka fuq l-alterazzjoni ta 'exosomal miR-21 fil-mikroglia ospitanti infettati b'Toxoplasma BV2.Aħna osservajna rwol possibbli ta 'miR-21 exosomal mibdul fit-tkabbir taċ-ċelluli tal-glijoma U87 minħabba ż-żamma fin-nukleu ta' FoxO1/p27, li hija l-mira ta 'miR-21 espressa żżejjed.
Exosomes derivati ​​minn BV2 inkisbu bl-użu ta 'ċentrifugazzjoni differenzjali u vvalidati b'diversi metodi biex tiġi evitata l-kontaminazzjoni b'komponenti ċellulari jew vesikoli oħra.L-elettroforeżi tal-ġel SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) wriet mudelli distinti bejn proteini estratti minn ċelluli BV2 u exosomes (Figura 1A), u l-kampjuni ġew evalwati għall-preżenza ta 'Alix, li ġiet analizzata minn Western blotting ta' markaturi ta 'proteini exosomal fi .It-tikkettar ta 'Alix instab fil-proteini exosome iżda mhux fil-proteini lisati taċ-ċelluli BV2 (Fig. 1B).Barra minn hekk, RNA purifikat minn exosomes derivati ​​minn BV2 ġie analizzat bl-użu ta 'bijoanalizzatur.Is-subunitajiet ribosomali 18S u 28S rarament ġew osservati fil-mudell tal-migrazzjoni tal-RNA exosomal, li jindika purità affidabbli (Figura 1C).Fl-aħħarnett, il-mikroskopija elettronika tat-trażmissjoni wriet li l-eżosomi osservati kienu ta 'daqs ta' madwar 60-150 nm u kellhom struttura bħal tazza tipika tal-morfoloġija tal-eżosomi (Fig. 1D).
Karatterizzazzjoni ta 'eżosomi derivati ​​minn ċelluli BV2.(A) Paġna tal-folja tad-dejta tas-sigurtà.Proteini ġew iżolati minn ċelluli BV2 jew exosomes derivati ​​minn BV2.Il-mudelli tal-proteini jvarjaw bejn iċ-ċelloli u l-eżosomi.(B) Analiżi Western blot ta 'markatur eżosomali (Alix).(C) Evalwazzjoni ta 'RNA purifikat minn ċelluli BV2 u exosomes derivati ​​minn BV2 bl-użu ta' bioanalizzatur.Għalhekk, subunitajiet ribosomali 18S u 28S fiċ-ċelloli BV2 rarament instabu fl-RNA eżosomali.(D) Il-mikroskopija elettronika ta 'trażmissjoni wriet li l-eżosomi iżolati miċ-ċelloli BV2 kienu mtebbgħin b'mod negattiv b'2% aċetat ta' uranil.Exosomes huma madwar 60-150 nm fid-daqs u forma ta 'tazza (Song u Jung, dejta mhux ippubblikata).
L-internalizzazzjoni ċellulari ta 'eżosomi derivati ​​minn BV2 f'ċelluli tal-glijoma umana U87 kienet osservata bl-użu ta' mikroskopija konfokali.Exosomes ittikkettjati PKH26 huma lokalizzati fiċ-ċitoplasma taċ-ċelloli U87.Nuklei kienu mtebbgħin b'DAPI (Fig. 2A), li jindika li exosomes derivati ​​minn BV2 jistgħu jiġu internalizzati minn ċelloli ospitanti u jinfluwenzaw l-ambjent taċ-ċelloli riċevituri.
L-internalizzazzjoni ta 'eżosomi derivati ​​minn BV2 f'ċelluli tal-glijoma U87 u exosomes derivati ​​minn BV2 infettati b'Toxoplasma RH indotta proliferazzjoni ta' ċelluli glijoma U87.(A) Exosomes maħkuma minn ċelluli U87 imkejla b'mikroskopija konfokali.Iċ-ċelloli tal-glijoma U87 ġew inkubati b'eżosomi ttikkettjati b'PKH26 (aħmar) jew mingħajr kontroll għal 24 siegħa.In-nuklei ġew imtebba 'b'DAPI (blu) u mbagħad osservati taħt mikroskopju konfokali (bar tal-iskala: 10 μm, x 3000).(B) Il-proliferazzjoni taċ-ċelluli tal-glioma U87 ġiet iddeterminata permezz ta 'assaġġ ta' proliferazzjoni taċ-ċelluli.Iċ-ċelloli tal-glijoma U87 ġew ittrattati b'eżosomi għaż-żmien indikat. *P <0.05 inkiseb bit-test t ta' Student. *P <0.05 inkiseb bit-test t ta' Student. *P < 0,05 получено по t-критерию Стьюдента. *P < 0.05 mit-test t ta' Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 miksub bl-użu tat-test t ta' Student.
Wara li kkonfermajna l-internalizzazzjoni ta 'eżosomi derivati ​​minn BV2 f'ċelluli glijoma U87, wettaqna analiżi ta' proliferazzjoni taċ-ċelluli biex ninvestigaw ir-rwol ta 'eżosomi derivati ​​minn Toxoplasma BV2 fl-iżvilupp ta' ċelluli glijoma umana.It-trattament ta 'ċelluli U87 b'exosomes minn ċelluli BV2 infettati minn T. gondii wera li exosomes derivati ​​minn BV2 infettati minn T. gondii ikkawżaw proliferazzjoni ogħla b'mod sinifikanti ta' ċelluli U87 meta mqabbla mal-kontroll (Fig. 2B).
Barra minn hekk, it-tkabbir taċ-ċelloli U118 kellu l-istess riżultati bħal U87, peress li l-eżosomi stimulati minn Toxoplasma kkawżaw l-ogħla livelli ta 'proliferazzjoni (dejta mhux murija).Ibbażat fuq din id-dejta, nistgħu nindikaw li l-eżosomi infettati minn Toxoplasma derivati ​​minn BV2 għandhom rwol importanti fil-proliferazzjoni taċ-ċelluli glijoma.
Biex tinvestiga l-effett ta 'eżosomi derivati ​​minn BV2 infettati minn Toxoplasma fuq l-iżvilupp tat-tumur, injettajna ċelluli tal-glioma U87 fi ġrieden nude għal mudell ta' xenograft u injettajna eżosomi derivati ​​minn BV2 jew eżosomi derivati ​​minn BV2 infettati minn RH.Wara li t-tumuri saru evidenti wara ġimgħa, kull grupp sperimentali ta '5 ġrieden kien maqsum skont id-daqs tat-tumur biex jiddetermina l-istess punt tat-tluq, u d-daqs tat-tumur kien imkejjel għal 22 jum.
Fil-ġrieden bil-mudell xenograft U87, id-daqs u l-piż tat-tumur b'mod sinifikanti akbar kienu osservati fil-grupp exosome infettat b'RH derivat minn BV2 f'jum 22 (Fig. 3A, B).Min-naħa l-oħra, ma kien hemm l-ebda differenza sinifikanti fid-daqs tat-tumur bejn il-grupp ta 'exosome derivat minn BV2 u l-grupp ta' kontroll wara t-trattament ta 'exosome.Barra minn hekk, ġrieden injettati b'ċelluli glijoma u exosomes viżwalment murija l-akbar volum ta 'tumur fil-grupp ta' exosomes derivati ​​minn BV2 infettati b'RH (Fig. 3C).Dawn ir-riżultati juru li eżosomi infettati b'Toxoplasma derivati ​​minn BV2 jinduċu tkabbir tal-glijoma f'mudell ta 'tumur tal-ġrieden.
Onkoġenesi (AC) ta 'eżosomi derivati ​​minn BV2 f'mudell ta' ġurdien xenograft U87.Id-daqs tat-tumur (A) u l-piż (B) żdiedu b'mod sinifikanti fil-ġrieden nude BALB/c ittrattati b'eżosomi infettati b'RH derivati ​​minn BV2.Ġrieden nude BALB/c (C) ġew injettati taħt il-ġilda b'1 x 107 ċelluli U87 sospiżi f'taħlita Matrigel.Sitt ijiem wara l-injezzjoni, 100 μg ta 'eżosomi derivati ​​minn BV2 ġew ittrattati fil-ġrieden.Id-daqs u l-piż tat-tumur ġew imkejla fil-jiem indikati u wara s-sagrifiċċju, rispettivament. *P < 0.05. *P < 0.05. *Р < 0,05. *P < 0.05. *P <0.05。 *P <0.05。 *Р < 0,05. *P < 0.05.
Id-dejta wriet li 37 miRNAs (16 overexpressed u 21 downexpressed) assoċjati mal-immunità jew l-iżvilupp tat-tumur ġew mibdula b'mod sinifikanti fil-mikroglia wara infezzjoni bir-razza Toxoplasma RH (Fig. 4A).Livelli ta 'espressjoni relattiva ta' miR-21 fost miRNAs mibdula ġew ikkonfermati minn RT-PCR f'ħin reali f'exosomes derivati ​​minn BV2, exosomes ittrattati b'ċelluli BV2 u U87.L-espressjoni ta 'miR-21 wriet żieda sinifikanti f'eżosomi minn ċelluli BV2 infettati b'Toxoplasma gondii (razza RH) (Fig. 4B).Livelli ta 'espressjoni relattiva ta' miR-21 fiċ-ċelloli BV2 u U87 żdiedu wara l-assorbiment ta 'exosomes mibdula (Fig. 4B).Il-livelli relattivi ta 'espressjoni ta' miR-21 fit-tessuti tal-moħħ ta 'pazjenti b'tumuri u ġrieden infettati b'Toxoplasma gondii (razza ME49) kienu ogħla milli fil-kontrolli, rispettivament (Fig. 4C).Dawn ir-riżultati jikkorrelataw ma' differenzi bejn il-livelli ta' espressjoni ta' microRNAs previsti u kkonfermati in vitro u in vivo.
Bidliet fl-espressjoni ta 'miP-21a-5p exosomal fil-mikroglia infettati b'Toxoplasma gondii (RH).(A) Juri bidliet sinifikanti fis-siRNA assoċjati ma 'l-immunità jew l-iżvilupp tat-tumur wara infezzjoni ta' T. gondii RH.(B) Livelli ta 'espressjoni ta' miR-21 relattivi ġew skoperti minn RT-PCR f'ħin reali f'eżosomi derivati ​​minn BV2, exosomes ittrattati b'BV2 u ċelloli U87.(C) Instabu livelli relattivi ta 'espressjoni ta' miR-21 fit-tessuti tal-moħħ ta 'pazjenti b'tumur (N=3) u ġrieden infettati b'Toxoplasma gondii (razza ME49) (N=3). *P <0.05 inkiseb bit-test t ta' Student. *P <0.05 inkiseb bit-test t ta' Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 inkiseb bl-użu tat-test t ta' Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 miksub bl-użu tat-test t ta' Student.
Exosomes minn ċelluli BV2 infettati bl-RH wasslu għat-tkabbir ta 'gliomi in vivo u in vitro (Fig. 2, 3).Biex tiskopri mRNAs rilevanti, eżaminajna livelli ta 'mRNA ta' ġeni fil-mira antitumorali, forkhead box O1 (FoxO1), PTEN, u mewt taċ-ċelluli programmata 4 (PDCD4) f'ċelloli U87 infettati b'eżosomi derivati ​​minn BV2 jew RH BV2.L-analiżi tal-bijoinformatika wriet li bosta ġeni assoċjati mat-tumur, inklużi l-ġeni FoxO1, PTEN, u PDCD4, għandhom siti ta 'rbit ta' miR-2121,22.Livelli ta 'mRNA ta' ġeni fil-mira antitumorali tnaqqsu f'exosomes derivati ​​minn BV2 infettati b'RH meta mqabbla ma 'exosomes derivati ​​minn BV2 (Fig. 5A).FoxO1 wera livelli mnaqqsa ta' proteini f'eżosomi derivati ​​minn BV2 infettati b'RH meta mqabbla ma 'eżosomi derivati ​​minn BV2 (Figura 5B).Ibbażat fuq dawn ir-riżultati, nistgħu nikkonfermaw li l-eżosomi derivati ​​minn BV2 infettat bl-RH jirregolaw ġeni anti-onkoġeniċi, u jżommu r-rwol tagħhom fit-tkabbir tat-tumur.
Exosomes derivati ​​minn BV2 infettati minn Toxoplasma RH jinduċu soppressjoni ta 'ġeni antitumorali f'ċelloli glijoma U87 minn eżosomi derivati ​​minn BV2 infettati minn Toxoplasma RH.(A) PCR f'ħin reali ta 'espressjoni ta' FoxO1, PTEN u PDCD4 f'eżosomi derivati ​​minn BV2 infettat minn T. gondii RH meta mqabbla ma 'eżosomi PBS.β-actin mRNA intuża bħala kontroll.(B) L-espressjoni ta 'FoxO1 ġiet iddeterminata permezz ta' Western blotting u d-dejta tad-densitometrija ġiet evalwata statistikament bl-użu tal-programm ImageJ. *P <0.05 inkiseb bit-test t ta' Student. *P <0.05 inkiseb bit-test t ta' Student. *P < 0,05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. *P <0.05 inkiseb bl-użu tat-test t ta' Student. *P < 0.05 通过学生t 检验获得。 *P < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * P < 0.05 miksub bl-użu tat-test t ta' Student.
Biex tifhem l-effett ta 'miP-21 fl-eżosomi fuq ir-regolamentazzjoni tal-ġeni assoċjati mat-tumur, iċ-ċelloli U87 ġew trasfettati b'inibitur ta' miP-21 bl-użu ta 'Lipofectamine 2000 u ċ-ċelloli nħasdu 24 siegħa wara t-trasfezzjoni.Livelli ta 'espressjoni ta' FoxO1 u p27 f'ċelloli trasfettati b'inibituri ta 'miR-21 tqabblu ma' ċelloli ttrattati b'eżosomi derivati ​​minn BV2 bl-użu ta 'qRT-PCR (Fig. 6A, B).It-trasfezzjoni tal-inibitur miR-21 f'ċelluli U87 irregolat b'mod sinifikanti l-espressjoni ta' FoxO1 u p27 (FIG. 6).
MiP-21 miP-21 infettat minn eżosomali infettat b'RH biddlet l-espressjoni ta 'FoxO1/p27 fiċ-ċelloli tal-glijoma U87.Iċ-ċelloli U87 ġew trasfettati b'inibitur miP-21 bl-użu ta 'Lipofectamine 2000 u ċ-ċelloli ġew maħsuda 24 siegħa wara t-trasfezzjoni.Livelli ta 'espressjoni ta' FoxO1 u p27 f'ċelloli trasfettati b'inibituri miR-21 tqabblu ma 'livelli f'ċelloli ttrattati b'eżosomi derivati ​​minn BV2 bl-użu ta' qRT-PCR (A, B).
Biex jaħrab mir-rispons immuni tal-ospitant, il-parassita Toxoplasma jittrasforma f'ċisti fit-tessut.Jiparassitaw diversi tessuti, inklużi l-moħħ, il-qalb u l-muskolu skeletriku, matul il-ħajja tal-ospitant u jimmodulaw ir-rispons immuni tal-ospitant.Barra minn hekk, jistgħu jirregolaw iċ-ċiklu taċ-ċelluli u l-apoptosi taċ-ċelloli ospitanti, u jippromwovu l-proliferazzjoni tagħhom14,24.Toxoplasma gondii jinfetta b'mod predominanti ċelluli dendritiċi ospitanti, newtrofili, u nisel ta' monoċiti/makrofagi, inkluż mikroglia tal-moħħ.Toxoplasma gondii jinduċi d-differenzjazzjoni tal-makrofaġi tal-fenotip M2, taffettwa l-fejqan tal-feriti wara infezzjoni tal-patoġenu, u hija assoċjata wkoll ma 'ipervaskularizzazzjoni u fibrożi granulomatoża.Din il-patoġenesi tal-imġieba tal-infezzjoni Toxoplasma tista 'tkun relatata ma' markaturi assoċjati mal-iżvilupp tat-tumur.L-ambjent ostili regolat minn Toxoplasma jista 'jixbah il-prekanċer korrispondenti.Għalhekk, wieħed jista’ jassumi li l-infezzjoni Toxoplasma għandha tikkontribwixxi għall-iżvilupp ta’ tumuri tal-moħħ.Fil-fatt, rati għoljin ta 'infezzjoni Toxoplasma ġew irrappurtati fis-serum ta' pazjenti b'diversi tumuri tal-moħħ.Barra minn hekk, Toxoplasma gondii jista 'jkun effettur karċinoġeniku ieħor u jaġixxi b'mod sinerġiku biex jgħin karċinoġeni infettivi oħra jiżviluppaw tumuri tal-moħħ.F'dan ir-rigward, ta 'min jinnota li P. falciparum u l-virus Epstein-Barr jikkontribwixxu b'mod sinerġiku għall-formazzjoni tal-limfoma ta' Burkitt.
Ir-rwol tal-eżosomi bħala regolaturi fil-qasam tar-riċerka tal-kanċer ġie investigat b'mod estensiv.Madankollu, ir-rwol tal-eżosomi bejn il-parassiti u l-ospiti infettati għadu mhux mifhum.S'issa, diversi regolaturi, inklużi proteini mnixxija, spjegaw il-proċessi bijoloġiċi li bihom il-parassiti protożoan jirreżistu l-attakk tal-ospitanti u jipperpetwaw l-infezzjoni.Riċentement, kien hemm kunċett dejjem jikber li l-mikrovesicles assoċjati mal-protożoan u l-microRNAs tagħhom jinteraġixxu maċ-ċelloli ospitanti biex joħolqu ambjent favorevoli għas-sopravivenza tagħhom.Għalhekk, huma meħtieġa aktar studji biex tiġi skoperta r-relazzjoni bejn miRNAs eżosomali mibdula u l-proliferazzjoni taċ-ċelluli glijoma.L-alterazzjoni tal-MicroRNA (cluster genes miR-30c-1, miR-125b-2, miR-23b-27b-24-1 u miR-17-92) tingħaqad mal-promotur STAT3 fil-makrofaġi umani infettati bit-toxoplasma, hija regolata u tinduċi anti -apoptożi b'reazzjoni għall-infezzjoni Toxoplasma gondii 29 .L-infezzjoni ta 'toxoplasma żżid l-espressjoni ta' miR-17-5p u miR-106b-5p, li huma assoċjati ma 'diversi mard iperproliferattiv 30 .Din id-dejta tissuġġerixxi li l-miRNAs ospitanti regolati mill-infezzjoni Toxoplasma huma molekuli importanti għas-sopravivenza tal-parassiti u l-patoġenesi fl-imġieba bijoloġika ospitanti.
MiRNAs mibdula jistgħu jinfluwenzaw diversi tipi ta 'mġieba matul il-bidu u l-progressjoni ta' ċelluli malinni, inklużi glijomi: awtosuffiċjenza ta 'sinjali ta' tkabbir, insensittività għal sinjali li jinibixxu t-tkabbir, evażjoni ta 'apoptosi, potenzjal replikattiv illimitat, anġjoġenesi, invażjoni u metastasi, u infjammazzjoni.Fil-glijoma, miRNAs mibdula ġew identifikati f'diversi studji tal-profil tal-espressjoni.
Fl-istudju preżenti, aħna kkonfermajna livelli għoljin ta 'espressjoni ta' miRNA-21 f'ċelloli ospitanti infettati bit-toxoplasma.miR-21 ġie identifikat bħala wieħed mill-mikroRNAs espressi żżejjed ta 'spiss f'tumuri solidi, inklużi glijomi, 33 u l-espressjoni tiegħu tikkorrelata mal-grad ta' glijoma.L-evidenza akkumulata tissuġġerixxi li miR-21 huwa onkoġen ġdid li jaġixxi bħala fattur anti-apoptotiku fit-tkabbir tal-glijoma u huwa espress ħafna fit-tessuti u fil-plażma ta 'tumuri malinni tal-moħħ tal-bniedem.Interessanti, l-inattivazzjoni ta 'miR-21 fiċ-ċelloli u t-tessuti tal-glijoma tikkawża l-inibizzjoni tal-proliferazzjoni taċ-ċelluli minħabba apoptosi dipendenti fuq il-caspase.Analiżi bijoinformatika ta 'miR-21 mbassra miri żvelat ġeni multipli li jrażżnu t-tumur assoċjati ma' mogħdijiet ta 'apoptosi, inkluż mewt taċ-ċelluli programmata 4 (PDCD4), tropomyosin (TPM1), PTEN, u forkhead box O1 (FoxO1), bis-sit ta' rbit ta 'miR-2121..22.38.
FoxO1, bħala wieħed mill-fatturi tat-traskrizzjoni (FoxO), huwa involut fl-iżvilupp ta 'diversi tipi ta' kanċer tal-bniedem u jista 'jirregola l-espressjoni ta' ġeni li jrażżan it-tumur bħal p21, p27, Bim, u FasL40.FoxO1 jista 'jorbot u jattiva inibituri taċ-ċiklu taċ-ċelluli bħal p27 biex irażżan it-tkabbir taċ-ċelluli.Barra minn hekk, FoxO1 huwa effettur ewlieni tas-sinjalar PI3K/Akt u jirregola ħafna proċessi bijoloġiċi bħall-progressjoni taċ-ċiklu taċ-ċelluli u d-divrenzjar taċ-ċelluli permezz tal-attivazzjoni tat-traskrizzjoni p2742.
Bħala konklużjoni, aħna nemmnu li exosomal miR-21 derivat minn microglia infettati minn Toxoplasma jista 'jkollhom rwol importanti bħala regolatur tat-tkabbir taċ-ċelluli glijoma (Fig. 7).Madankollu, aktar studji huma meħtieġa biex tinstab rabta diretta bejn exosomal miR-21, infezzjoni Toxoplasma mibdula, u t-tkabbir tal-glijoma.Dawn ir-riżultati huma mistennija li jipprovdu punt tat-tluq għall-istudju tar-relazzjoni bejn l-infezzjoni Toxoplasma u l-inċidenza tal-glijoma.
F'dan l-istudju hija proposta dijagramma skematika tal-mekkaniżmu tal-karċinoġenesi tal-glijoma (moħħ).L-awtur jiġbed fil-PowerPoint 2019 (Microsoft, Redmond, WA).
Il-protokolli sperimentali kollha f'dan l-istudju, inkluż l-użu ta 'annimali, kienu skont il-Linji Gwida Etiċi Standard tal-Kumitat għall-Kura tal-Annimali tal-Università Nazzjonali ta' Seoul u l-Utenti u ġew approvati mill-Bord ta 'Reviżjoni Istituzzjonali tal-Iskola tal-Mediċina tal-Università Nazzjonali ta' Seoul (numru IRB SNU- 150715).-2).Il-proċeduri sperimentali kollha twettqu skont ir-rakkomandazzjonijiet ARRIVE.
Il-mikroglia tal-ġurdien BV2 u ċ-ċelluli tal-glijoma umana U87 ġew ikkultivati ​​fil-Medju tal-Ajkla Modifikat ta' Dulbecco (DMEM; Welgene, Seoul, Korea) u l-Medju tal-Istitut Roswell Park Memorial (RPMI; Welgene), rispettivament, kull wieħed kien fih 10% serum bovin tal-fetu, 4 mM l- glutamina, 0.2 mM peniċillina u 0.05 mM streptomycin.Iċ-ċelloli ġew ikkultivati ​​f'inkubatur b'5% CO2 f'37°C.Linja taċ-ċelluli glijoma oħra, U118, intużat għal tqabbil maċ-ċelloli U87.
Biex jiġu iżolati exosomes minn razez RH u ME49 infettati minn T. gondii, it-tachyzoites ta 'T. gondii (razza RH) inħasdu mill-kavità addominali ta' ġrieden BALB/c ta '6 ġimgħat injettati 3-4 ijiem qabel.It-takiżoiti ġew maħsula tliet darbiet bil-PBS u ppurifikati permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'40% Percoll (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)43.Biex tikseb it-tachyzoites tar-razza ME49, il-ġrieden BALB/c ġew injettati intraperitonealment b'20 ċisti fit-tessuti u t-trasformazzjoni tat-tachyzoite fiċ-ċisti nġabret bil-ħasil tal-kavità addominali fis-6-8 jum wara l-infezzjoni (PI).Ġrieden infettati bil-PBS.Tachyzoites ME49 tkabbru f'ċelloli supplimentati b'100 μg/ml peniċillina (Gibco/BRL, Grand Island, NY, USA), 100 μg/ml streptomycin (Gibco/BRL), u 5% serum tal-fetu bovin (Lonza, Walkersville, MD) .., USA) f'37 °C u 5% dijossidu tal-karbonju.Wara l-kultivazzjoni fiċ-ċelloli Vero, it-takiżoiti ME49 ġew mgħoddija darbtejn minn labra ta' kejl ta' 25 u mbagħad minn filtru ta' 5 µm biex jitneħħew id-debris u ċ-ċelloli.Wara l-ħasil, it-tachyzoites ġew sospiżi mill-ġdid f'PBS44.Ċisti fit-tessut tar-razza ME49 ta 'Toxoplasma gondii nżammu b'injezzjoni intraperitoneali ta' ċisti iżolati mill-moħħ ta 'ġrieden C57BL/6 infettati (Orient Bio Animal Center, Seongnam, Korea).L-imħuħ tal-ġrieden infettati b'ME49 inħasdu wara 3 xhur ta 'PI u kkapuljati taħt mikroskopju biex iżolati ċ-ċisti.Il-ġrieden infettati nżammu taħt kundizzjonijiet speċjali ħielsa minn patoġeni (SPF) fl-Iskola tal-Mediċina tal-Università Nazzjonali ta 'Seoul.
L-RNA totali ġie estratt minn exosomes derivati ​​minn BV2, ċelluli BV2 u tessuti bl-użu tal-miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, il-Ġermanja) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur, inkluż il-ħin ta 'inkubazzjoni għall-pass ta' elużjoni.Il-konċentrazzjoni tal-RNA ġiet iddeterminata fuq spettrofotometru NanoDrop 2000.Il-kwalità tal-mikroarrays RNA ġiet evalwata bl-użu ta 'bijoanalizzatur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Amstelveen, l-Olanda).
DMEM b'10% FBS fqir f'eżosoma ġie ppreparat permezz ta' ultracentrifugazzjoni f'100,000g għal 16-il siegħa f'4 ° C u ffiltrat permezz ta 'filtru ta' 0.22 µm (Nalgene, Rochester, NY, USA).Iċ-ċelloli BV2, 5 × 105, ġew ikkultivati ​​f'DMEM li kien fih 10% FBS eżawrit bl-eżosomi u 1% antibijotiċi f'37 ° C u 5% CO2.Wara 24 siegħa ta 'inkubazzjoni, tachyzoites ta' razza RH jew ME49 (MOI = 10) ġew miżjuda maċ-ċelloli u parassiti li ma jinvadux tneħħew fi żmien siegħa u jerġgħu jimtlew b'DMEM.Exosomes miċ-ċelloli BV2 ġew iżolati permezz ta 'ċentrifugazzjoni differenzjali modifikata, l-aktar metodu użat.Erġa' ssospendi l-pellet exosome fi 300 µl PBS għall-analiżi tal-RNA jew tal-proteini.Il-konċentrazzjoni ta 'eżosomi iżolati ġiet iddeterminata bl-użu ta' kit ta 'assaġġ tal-proteina BCA (Pierce, Rockford, IL, USA) u spettrofotometru NanoDrop 2000.
Preċipitati minn ċelluli BV2 jew exosomes derivati ​​minn BV2 ġew lysed f'soluzzjoni ta 'estrazzjoni ta' proteini PRO-PREP ™ (iNtRon Biotechnology, Seongnam, Korea) u proteini ġew mgħobbija fuq ġels tal-poliacrilamide SDS ta '10% mtebbgħin blu brillanti Coomassie.Barra minn hekk, il-proteini ġew trasferiti għal membrani PVDF għal sagħtejn.Western blots ġew ivvalidati bl-użu tal-antikorp Alix (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) bħala markatur eżosomali.IgG kontra l-ġurdien tal-mogħoż konjugat bl-HRP (H + L) (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) u analizzatur ta 'immaġni luminexxenti LAS-1000 plus (Fuji Photographic Film, Tokyo, Ġappun) intużaw bħala antikorp sekondarju..Twettqet mikroskopija elettronika ta 'trażmissjoni biex tistudja d-daqs u l-morfoloġija tal-eżosomi.Exosomes iżolati miċ-ċelluli BV2 (6.40 µg/µl) ġew ippreparati fuq malji miksija bil-karbonju u mtebbgħin b'mod negattiv b'2% uranyl acetate għal 1 min.Il-kampjuni ppreparati ġew osservati f'vultaġġ ta 'aċċellerazzjoni ta' 80 kV bl-użu ta 'JEOL 1200-EX II (Tokyo, Ġappun) mgħammra b'kamera ES1000W Erlangshen CCD (Gatan, Pleasanton, CA, USA).
Exosomes derivati ​​minn BV2 ġew imtebba bl-użu tal-Kit ta 'Linker Fluworexxenti Aħmar PKH26 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) għal 15-il minuta f'temperatura tal-kamra.Ċelloli U87, 2 × 105, b'eżosomi ttikkettjati PKH26 (aħmar) jew l-ebda exosomes bħala kontroll negattiv, ġew inkubati f'37 ° C għal 24 siegħa f'inkubatur ta '5% CO2.Nuklei taċ-ċelluli U87 kienu mtebbgħin b'DAPI (blu), iċ-ċelloli U87 ġew iffissati f'4% paraformaldehyde għal 15-il minuta f'4 ° C u mbagħad analizzati f'sistema ta 'mikroskopju konfokali Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems, Mannheim, Ġermanja).osservabbli.
cDNA ġie sintetizzat minn siRNA bl-użu ta 'sinteżi tal-ewwel strand Mir-X siRNA u kit SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc., Shiga, Ġappun).PCR kwantitattiv f'ħin reali twettqet bl-użu tas-sistema ta 'detezzjoni ta' PCR f'ħin reali iQ5 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) bl-użu ta 'primers u mudelli mħallta ma' SYBR Premix.Id-DNA ġie amplifikat għal 40 ċiklu ta 'denaturazzjoni f'95 ° C għal 15 s u ittemprar f'60 ° C għal 60 s.Id-dejta minn kull reazzjoni tal-PCR ġiet analizzata bl-użu tal-modulu tal-analiżi tad-dejta tas-softwer tas-sistema ottika iQ™5 (Bio-Rad).Bidliet relattivi fl-espressjoni tal-ġeni bejn ġeni fil-mira magħżula u β-actin/siRNA (u U6) ġew ikkalkulati bl-użu tal-metodu tal-kurva standard.Is-sekwenzi tal-primer użati huma murija fit-Tabella 1.
3 x 104 ċelluli tal-glijoma U87 ġew miżrugħa fi pjanċi 96-well u mħallta ma 'eżosomi infettati b'Toxoplasma derivati ​​minn BV2 (50 μg/mL) jew exosomes nonpulse derivati ​​minn BV2 (50 μg/mL) bħala kontrolli fi 12, 18 u 36 siegħa .Ir-rata ta 'proliferazzjoni taċ-ċelluli ġiet iddeterminata bl-użu taċ-Ċelluli Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, il-Ġappun) (Figuri Supplimentari S1-S3) 46 .
Ġrieden femminili BALB/c nude ta’ 5 ġimgħat inxtraw minn Orient Bio (Seongnam-si, Korea t’Isfel) u nżammu individwalment f’gaġeġ sterili f’temperatura tal-kamra (22±2 °C) u umdità (45±15 °C).%) f'temperatura tal-kamra (22±2°C) u umdità (45±15%).Twettqu ċiklu ta 'dawl ta' 12-il siegħa u ċiklu ta 'dlam ta' 12-il siegħa taħt SPF (Seoul National University School of Medicine Animal Center).Il-ġrieden ġew maqsuma b'mod każwali fi tliet gruppi ta '5 ġrieden kull wieħed u l-gruppi kollha ġew injettati taħt il-ġilda b'400 ml ta' PBS li fihom 1 x 107 ċelluli glijoma U87 u BD Matrigel™ imnaqqas b'fattur ta 'tkabbir (BD Science, Miami, FL, USA).Sitt ijiem wara l-injezzjoni tat-tumur, 200 mg ta 'eżosomi derivati ​​minn ċelluli BV2 (b'/mingħajr infezzjoni Toxoplasma) ġew injettati fis-sit tat-tumur.Tnejn u għoxrin jum wara l-infezzjoni tat-tumur, id-daqs tat-tumur tal-ġrieden f'kull grupp kien imkejjel b'kalibru tliet darbiet fil-ġimgħa, u l-volum tat-tumur ġie kkalkulat bil-formula: 0.5 × (wisa ') × 2 × tul.
Analiżi ta 'espressjoni ta' MicroRNA bl-użu ta 'miRCURYTM LNA miRNA array, 7th generation has, mmu and rno arrays (EXIQON, Vedbaek, Danimarka) li jkopru 1119 ġrieden karatterizzati tajjeb fost 3100 sondi tal-qbid miRNA tal-bniedem, ġurdien u firien.Matul din il-proċedura, 250 sa 1000 ng ta 'RNA totali tneħħew mill-5'-fosfat permezz ta' trattament b'fosfati alkalini intestinali tal-għoġol segwit minn tikkettjar b'żebgħa fluworexxenti aħdar Hy3.Il-kampjuni ttikkettjati mbagħad ġew ibridizzati billi tgħabbew slides tal-mikroarray bl-użu ta 'kit tal-kamra tal-ibridizzazzjoni (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) u kit ta' slide tal-ibridizzazzjoni (Agilent Technologies).L-ibridizzazzjoni saret għal 16-il siegħa f'56 ° C, imbagħad il-mikroarrays ġew maħsula skont ir-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur.Il-pjastri tal-mikroarray ipproċessati mbagħad ġew skannjati bl-użu ta 'sistema tal-iskaner tal-mikroarray Agilent G2565CA (Agilent Technologies).Immaġini skannjati ġew importati bl-użu tas-softwer Agilent Feature Extraction verżjoni 10.7.3.1 (Agilent Technologies) u l-intensità tal-fluworexxenza ta 'kull immaġini ġiet kwantifikata bl-użu tal-fajl GAL korrispondenti tal-protokoll Exiqon modifikat.Id-dejta tal-Microarray għall-istudju attwali hija depożitata fid-database GEO taħt in-numru ta 'adeżjoni GPL32397.
Profili ta 'espressjoni ta' miRNAs exosomal maturi fil-mikroglia ta 'razez RH jew ME49 infettati b'Toxoplasma ġew analizzati bl-użu ta' diversi għodod tan-netwerk.miRNAs assoċjati mal-iżvilupp tat-tumur ġew identifikati bl-użu ta 'miRWalk2.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) u ffiltrati b'intensità tas-sinjal normalizzata (log2) akbar minn 8.0.Fost il-miRNAs, il-miRNAs espressi b'mod differenzjat instabu li kienu mibdula aktar minn 1.5 darbiet b'analiżi tal-filtru ta 'miRNAs mibdula minn razez RH jew ME49 infettati b'T. gondii.
Iċ-ċelloli ġew miżrugħa fi pjanċi ta 'sitt bir (3 x 105 ċelluli/bir) f'opti-MEM (Gibco, Carlsbad, CA, USA) bl-użu ta' Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).Iċ-ċelloli trasfettati ġew ikkultivati ​​għal 6 sigħat u mbagħad il-medium inbidel għal medium komplut frisk.Iċ-ċelloli nħasdu 24 siegħa wara t-trasfezzjoni.
L-analiżi statistika saret prinċipalment bl-użu tat-test t ta’ Student b’softwer Excel (Microsoft, Washington, DC, USA).Għal analiżi sperimentali tal-annimali, saret ANOVA f'żewġ direzzjonijiet bl-użu ta 'softwer Prism 3.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Il-valuri P < 0.05 tqiesu bħala statistikament sinifikanti. Il-valuri P < 0.05 tqiesu bħala statistikament sinifikanti. Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Il-valuri P <0.05 tqiesu statistikament sinifikanti. P 值< 0.05 被认为具有统计学意义。 P 值< 0.05 Значения P <0,05 считались статистически значимыми. Il-valuri P <0.05 tqiesu statistikament sinifikanti.
Il-protokolli sperimentali kollha użati f'dan l-istudju ġew approvati mill-Bord ta 'Reviżjoni Istituzzjonali tal-Iskola tal-Mediċina tal-Università Nazzjonali ta' Seoul (numru IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
Furley, J. et al.Stima tal-inċidenza u l-mortalità globali tal-kanċer fl-2018: sorsi u metodi GLOBOCAN.Interpretazzjoni.J. Ruck 144, 1941–1953 (2019).
Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Ħarsa lejn il-fatturi ta 'riskju ta' tumuri tal-moħħ u l-interventi terapewtiċi tagħhom. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Ħarsa lejn il-fatturi ta 'riskju ta' tumuri tal-moħħ u l-interventi terapewtiċi tagħhom.Rashid, S., Rehman, K. u Akash, MS Reviżjoni ta 'fatturi ta' riskju għal tumuri tal-moħħ u interventi terapewtiċi ewlenin. Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS 深入了解脑肿瘤的危险因素及其治疗干预措施。 Rasheed, S., Rehman, K. & Akash, MS Fehim profond ta 'fatturi ta' riskju ta 'tumur tal-moħħ u interventi terapewtiċi.Rashid, S., Rehman, K. u Akash, MS Reviżjoni ta 'fatturi ta' riskju għal tumuri tal-moħħ u interventi terapewtiċi ewlenin.Xjenza bijomedika.Spiżjar.143, 112119 (2021).
Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interazzjonijiet batterjali-virali f'kanċers tal-passaġġ ġenitali tal-bniedem u orodiġestivi tan-nisa: Sommarju tal-evidenza epidemjoloġika u tal-laboratorju. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interazzjonijiet batterjali-virali f'kanċers tal-passaġġ ġenitali tal-bniedem u orodiġestivi tan-nisa: Sommarju tal-evidenza epidemjoloġika u tal-laboratorju.Kato I., Zhang J. u Sun J. Interazzjonijiet batterjali-virali fil-kanċer tal-passaġġ gastrointestinali tal-bniedem u l-apparat ġenitali femminili: sommarju tad-dejta epidemjoloġika u tal-laboratorju. Kato, I., Zhang, J. & Sun, J.总结。 Kato, I., Zhang, J. & Sun, J. Interazzjoni batterjo-virali fid-diġestjoni tal-kavità orali tal-bniedem u l-apparat riproduttiv tan-nisa: sommarju tax-xjenza tal-mard popolari u l-evidenza tal-laboratorju.Kato I., Zhang J. u Sun J. Interazzjonijiet batterjali-virali fil-kanċer gastrointestinali tal-bniedem u l-kanċer ġenitali femminili: sommarju tad-dejta epidemjoloġika u tal-laboratorju.Kanċer 14, 425 (2022).
Magon, KL & Parish, JL Mill-infezzjoni għall-kanċer: Kif il-viruses tat-tumur tad-DNA jbiddlu l-metaboliżmu ċentrali tal-karbonju u tal-lipidi taċ-ċelluli ospitanti. Magon, KL & Parish, JL Mill-infezzjoni għall-kanċer: Kif il-viruses tat-tumur tad-DNA jbiddlu l-metaboliżmu ċentrali tal-karbonju u tal-lipidi taċ-ċelluli ospitanti.Mahon, KL u Parish, JL Infezzjoni tan-nar għall-kanċer: kif viruses tat-tumur ibbażati fuq id-DNA jbiddlu l-metaboliżmu ċentrali tal-karbonju u tal-lipidi taċ-ċelluli ospitanti. Magon, KL & Parish, JL 从感染到癌症：DNA 肿瘤病毒如何改变宿主细胞的中心碳和脂质䣂谢 Magon, KL & Parish, JL Mill-infezzjoni għall-kanċer: kif il-viruses tat-tumur tad-DNA jbiddlu l-metaboliżmu ċentrali tal-karbonju u tal-lipidi taċ-ċelluli ospitanti.Mahon, KL u Parish, JL Nirien infezzjoni għall-kanċer: kif il-viruses tat-tumur tad-DNA jbiddlu l-metaboliżmu ċentrali tal-karbonju u tal-lipidi fiċ-ċelloli ospitanti.Bijoloġija Miftuħa.11, 210004 (2021).
Correia da Costa, JM et al.Estroġeni tal-katekol ta' schistosomes u flukes tal-fwied u kanċer assoċjat mal-elminti.quddiem.sħun ġewwa.5, 444 (2014).