Giardia duodenum huwa organiżmu parassitiku li jikkawża ġardjażi, infezzjoni intestinali komuni speċjalment fi tfal żgħar b'sinjali kliniċi ta 'dijarea.Preċedentement irrappurtajna li G. duodenalis extraċellulari iqanqal l-attivazzjoni ta 'nukleotidi li jorbtu għar-riċettur 3 bħal oligomerizzazzjoni intraċellulari (NLRP3) u jirregola risponsi infjammatorji ospitanti permezz ta' sekrezzjoni ta 'vesikule extraċellulari (EV).Madankollu, il-mudelli molekulari eżatti tal-EV duodenococcal assoċjat mal-patoġenu (GEV) involuti f'dan il-proċess u r-rwol tal-inflammasome NLRP3 fil-ġardjażi għad iridu jiġu eluċidati.
Plasmidi ta 'espressjoni ewkarjotika rikombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 u alpha-7.3 giardins f'GEV ġew mibnija, trasfettati f'makrofaġi peritoneali primarji tal-ġrieden, u skoperti billi titkejjel il-molekula fil-mira ta' infjammazzjoni caspase-1.Il-livell ta' espressjoni p20 ġie skrinjat..G. duodenalis alpha-2 u alpha-7.3 giardines ġew identifikati oriġinarjament billi tkejjel NLRP3 inflammasome (NLRP3, pro-interleukin-1 beta [IL-1β], pro-caspase-1 u caspase-1 p20), sekrezzjoni IL.Livelli 1β, livelli ta 'oligomerizzazzjoni ta' proteina spotted apoptotic (ASC), u lokalizzazzjoni immunofluworexxenti ta 'NLRP3 u ASC.Ir-rwol tal-NLRP3 inflammasome fil-patoġeniċità ta 'G. duodenalis imbagħad ġie vvalutat bl-użu ta' ġrieden li fihom l-attivazzjoni ta 'NLRP3 kienet imblukkata (ġrieden imblukkati NLRP3) u bidliet patoloġiċi fil-piż tal-ġisem, tagħbija parassitika duwodenali u tessut duwodenali ġew immonitorjati.Barra minn hekk, investigajna jekk hiardines alpha-2 u alpha-7.3 jinduċux sekrezzjoni ta 'IL-1β in vivo permezz tal-inflammasome NLRP3 u ddeterminajna r-rwol ta' dawn il-molekuli fil-patoġeniċità ta 'G. duodenalis fil-ġrieden.
Alpha-2 u alpha-7.3 giardines jinduċu l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 in vitro.Dan wassal għall-attivazzjoni ta 'p20 caspase-1, żieda fil-livelli ta' espressjoni ta 'proteini NLRP3, pro-IL-1β, u pro-caspase-1, żieda sinifikanti fis-sekrezzjoni ta' IL-1β, il-formazzjoni ta 'tikek ASA fil- ċitoplasma, u l-induzzjoni ta 'oligomerizzazzjoni ASA.Infjammazzjoni NLRP3 It-telf tal-pene jaggrava l-patoġeniċità ta 'G. duodenalis fil-ġrieden.Ġrieden ittrattati b'ċisti permezz ta 'gavage minn ġrieden imblukkati b'NLRP3 urew numru akbar ta' trofożoiti u ħsara severa lill-villi duwodenali, ikkaratterizzati minn kripti nekrotiċi bi shrunken u fergħat.Esperimenti in vivo wrew li giardines alpha-2 u alpha-7.3 jistgħu jinduċu sekrezzjoni ta 'IL-1β permezz tal-inflammasome NLRP3, u l-immunizzazzjoni b'giardines alpha-2 u alpha-7.3 naqqset il-patoġeniċità ta' G. duodenalis fil-ġrieden.
Meħuda flimkien, ir-riżultati ta 'dan l-istudju jissuġġerixxu li giardia alpha-2 u alpha-7.3 jikkawżaw upregulation tal-infjammazzjoni NLRP3 ospitanti u jnaqqsu l-infettività ta' G. duodenalis fil-ġrieden, li huma miri promettenti għall-prevenzjoni tal-ġardjażi.
Giardia duodenum huwa parassita protożoan extraċellulari li jgħix fil-musrana ż-żgħira u jikkawża 280 miljun każ ta 'ġardjażi b'dijarea kull sena, speċjalment fost tfal żgħar f'pajjiżi li qed jiżviluppaw [1].In-nies jiġu infettati bl-ilma tax-xorb jew ikel ikkontaminat b'ċisti M. duodenum, li mbagħad jidħlu fl-istonku u jitneħħew fil-meraq tal-istonku.Giardia duodenum trophozoites jehmżu ma 'l-epitelju duwodenali, li jikkawżaw dardir, rimettar, dijarea, uġigħ addominali, u telf ta' piż.Individwi b'immunodefiċjenza u fibrożi ċistika huma suxxettibbli għall-infezzjoni.L-infezzjoni tista' sseħħ ukoll permezz ta' sess orali u anali [2].Mediċini bħal metronidazole, tinidazole, u nitazoxanide huma l-għażliet ta 'trattament preferuti għal infezzjonijiet duwodenali [3].Madankollu, dawn il-mediċini tal-kimoterapija jikkawżaw effetti sekondarji avversi bħal dardir, karċinoġenesi u ġenotossiċità [4].Għalhekk, jeħtieġ li jiġu żviluppati strateġiji aktar effettivi biex tiġi evitata l-infezzjoni ta 'G. duodenalis.
Inflammasomi huma klassi ta 'kumplessi ta' proteini ċitosoliċi li huma parti mir-rispons immuni intrinsiku, li jgħinu biex jiddefendu kontra l-invażjoni tal-patoġenu u jimmedjaw ir-risponsi infjammatorji [5].Fost dawn l-infjammasomi, l-infjammasomi simili li jgħaqqdu nukleotidi (NLRP3) tar-riċettur 3 (NLRP3) ta’ l-oligomerizzazzjoni li torbot nukleotidi (NOD) ġew studjati b’mod estensiv minħabba li jista’ jiġi skopert minn diversi mudelli molekulari assoċjati ma’ patoġeni/ħsarat (PAMP/ DAMP), jagħraf, jattiva s-sistema immuni intrinsika.u jirregola l-omeostażi intestinali f'ħafna mard infjammatorju [6,7,8].Tikkonsisti mir-riċettur tar-rikonoxximent tal-mudell (PRR) NLRP3, proteina spotted apoptotic adapter (ASC), u effector procaspase-1 jew procaspase-11.L-inflammasome NLRP3 jaġixxi bħala ospitanti kontra l-invażjoni tal-patoġenu, kif osservat fi studji Neospora caninum [9], Paracoccidioides brasiliensis [10], u Leishmania.[11], iżda ġie rrappurtat ukoll li l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 tillimita r-risponsi immuni protettivi u taggrava l-progressjoni tal-marda, pereżempju, fid-dud [12].Ibbażat fuq is-sejbiet preċedenti tagħna, aħna rrapportajna li G. duodenalis extraċellulari iqanqal attivazzjoni intraċellulari ta 'infjammazzjoni NLRP3 u jimmodula r-risponsi infjammatorji ospitanti billi jissekreġ vesicles extraċellulari (EVs) [13].Madankollu, ir-rwol tal-NLRP3 inflammasome fl-infezzjoni G. duodenalis in vivo għad irid jiġi determinat.
Giardins kienu oriġinarjament deskritti bħala komponenti strutturali taċ-ċitoskeletru G. duodenalis u għandhom rwol importanti fil-motilità trofozoite u t-twaħħil taċ-ċelluli epiteljali fil-musrana ż-żgħira.Biex jadattaw aħjar għall-ambjent u jżidu l-patoġeniċità tagħhom, G. duodenalis trophozoites żviluppaw struttura ċitoskeletali unika li tikkonsisti minn 8 flagella, korp tan-nofs, u diska ventrali 1 [14].It-trofozoiti ta 'Giardia duodenum jużaw iċ-ċitoskeletru tagħhom biex jippenetraw il-musrana ż-żgħira ta' fuq, speċjalment id-duwodenu, u jehmżu ma 'enteroċiti.Huma jemigraw kontinwament u jehmu maċ-ċelloli epiteljali bl-użu tal-metaboliżmu taċ-ċelluli.Għalhekk, hemm relazzjoni mill-qrib bejn iċ-ċitoskeletru u l-virulenza tagħhom.Giardini speċifiċi għal Giardia duodenum huma komponenti ta 'l-istruttura taċ-ċitoskeletru [15] u huma maqsuma f'erba' klassijiet: α-, β-, γ-, u δ-giardines.Hemm 21 membru tal-familja α-giardin, li kollha għandhom kapaċità dipendenti fuq il-kalċju li jorbtu l-fosfolipidi [16].Huma jgħaqqdu wkoll iċ-ċitoskeletru mal-membrana taċ-ċellula.F'individwi b'dijarea kkawżata minn G. duodenalis, α-giardins huma espressi ħafna u immunoreattivi waqt l-infezzjoni [17].Vaċċini eteroloġi bbażati fuq Giardia alfa-1 protetti kontra ġardjażi fil-ġrieden u huma antiġeni kandidati potenzjali għall-iżvilupp tal-vaċċin [18].Alpha-8 giardin, lokalizzat fil-membrana tal-plażma u l-flageli, iżda mhux fid-diska ventrali, isaħħaħ il-motilità u r-rata tat-tkabbir tat-trofozoiti f'G. duodenalis [19].Alpha-14 giardin jeħel ma' strutturi mikrotubuli fuq flagella u jaffettwa l-vijabbiltà ta 'G. duodenalis [20].Alpha-11 giardine huwa preżenti f'abbundanza matul iċ-ċiklu tal-ħajja, u l-espressjoni żejda ta 'alpha-11 giardine tagħmel ħsara lil G. duodenalis innifsu [21].Madankollu, mhuwiex ċar jekk alpha-2 giardine u alpha-7.3 giardine humiex protettivi kontra l-infezzjoni G. duodenalis u l-mekkaniżmi sottostanti tagħhom.
F'dan l-istudju, plasmidi ta 'espressjoni ewkarjotika rikombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine u pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ġew trasfettati f'makrofaġi peritoneali primarji tal-ġrieden biex jattivaw NLRP3 ospitanti.Il-miri tal-inflammasome imbagħad ġew skrinjati.Aħna vvalutajna wkoll ir-rwol tal-NLRP3 inflammasome fil-patoġeniċità ta 'G. duodenalis, investigajna jekk alpha-2 u alpha-7,3 giardines jinduċux attivazzjoni tal-NLRP3 inflammasome in vivo, u ddeterminajna li dawn iż-żewġ rwoli ta' giardines fil-patoġeniċità ta ' G. duodenalis.L-għan komuni tagħna kien li niżviluppaw miri promettenti għall-prevenzjoni ta 'infezzjoni ta' G. duodenalis.
Ġrieden nisa tat-tip selvaġġ (WT) C57BL/6 ta 'età ta' 5-8 ġimgħat inxtraw minn Liaoning Changsheng Experimental Animal Centre (Liaoning, iċ-Ċina).Il-ġrieden kellhom aċċess liberu għall-ilma, irċevew ikel sterilizzat u nżammu f'ċiklu ta 'dawl/dlam ta' 12/12 siegħa.Qabel l-infezzjoni, il-ġrieden irċevew antibijotiċi ad libitum fl-ilma tax-xorb supplimentat b'ampicillin (1 mg/mL), vancomycin (1 mg/mL), u neomycin (1.4 mg/mL) (kollha mixtrija minn Shanghai, iċ-Ċina, organiżmi artifiċjali) [22] ].].Ġrieden li tilfu l-abbiltà li jieklu u jixorbu għal> 24 siegħa u tilfu ≥ 20% tal-piż tal-ġisem ġew ewtanizzati b'mod uman permezz ta 'dislokazzjoni ċervikali.
WB G. duodenalis trophozoites (Ġbir tal-Kultura tat-Tip Amerikan, Manassas, USA) ġew supplimentati bi 12.5% ​​serum bovin tal-fetu (FBS; Kull Green, Zhejiang, iċ-Ċina) u 0.1% bili bovina (Sigma-Aldrich, St. Missouri, USA). ).USA) taħt kundizzjonijiet mikroaerobiċi.Trophozoites konfluwenti nġabru fuq is-silġ u mgħoddija fi proporzjon ta '1:4 għal aktar riproduzzjoni.
Ċisti Giardia duodenum ġew indotti kif deskritt qabel [23], trofozoiti ġew maħsuda f'fażi logaritmika u mbagħad dilwit b'mezz li jinduċi inkapsulament, pH 7.1 (modifikat TYI-S-33) għal konċentrazzjoni finali ta '1 × 106 trofozoiti / mL.konċentrazzjoni tal-bili 0.05% medju).Trophozoites kienu kkultivati ​​taħt kundizzjonijiet anerobiċi f'37 ° C sal-fażi ta 'tkabbir logaritmiku.Ibdel il-medju għal medju li jinduċi ċ-ċisti (pH 7.8; medju TYI-S-33 modifikat b'1% konċentrazzjoni tal-bili) u kultura G. duodenalis f'37 ° C għal 48-96 siegħa, li matulha ċ-ċisti ta 'formazzjoni ġew osservati taħt mikroskopju.Wara li l-biċċa l-kbira tat-trofożoiti kienu ġew indotti biex jiffurmaw ċisti, it-taħlita tal-kultura ġiet maħsuda u sospiża mill-ġdid f'ilma sterili dejonizzat biex lyse it-trofożoiti li kien fadal.Iċ-ċisti ġew magħduda u maħżuna f'4°C għal analiżi sussegwenti permezz ta 'tubu gastriku fil-ġrieden.
Il-vesikli extraċellulari Giardia (GEVs) ġew arrikkit kif deskritt qabel [13].Trophozoites f'fażi ta 'tkabbir logaritmiku ġew sospiżi mill-ġdid f'mezz TYI-S-33 modifikat ippreparat b'FBS eżawrit bl-exosome (Industriji Bijoloġiċi, Beit-Haemek, Iżrael) għal konċentrazzjoni finali ta' 1 × 106 parassiti / mL u inkubati għal 12-il siegħa.ġew iżolati mis-supernatant tal-kultura permezz ta 'ċentrifugazzjoni f'2000 g għal 10 min, 10,000 g għal 45 min, u 100,000 g għal 60 min.Il-preċipitati ġew maħlula f'salina buffered fosfat (PBS), ikkwantifikati bl-użu ta 'kit ta' analiżi tal-proteina BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) u maħżuna f'-80 ° C. jew użati direttament għal aktar analiżi.
Il-makrofaġi peritoneali tal-ġrieden primarji ġew ippreparati kif deskritt qabel [24].Fil-qosor, ġrieden (età 6-8 ġimgħat) ġew injettati (intraperitoneally [ip]) b'2.5 ml ta '2.98% Difco likwidu thioglycol medium (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) u mitmugħa 3-4 palates.Inġabret sospensjoni ta 'makrofaġi mill-kavità addominali tal-ġrieden wara l-ewtanasja u ċentrifugata 3 darbiet f'1000 g għal 10 min.Ċelloli maħsuda ġew skoperti permezz ta 'ċitometrija tal-fluss bl-użu tal-markatur CD11b sakemm il-purità taċ-ċellula kienet> 98%, imbagħad miżjuda ma' pjanċi ta 'kultura taċ-ċelluli b'6-well (4.5 x 106 ċelluli/bir) u inkubati b'10% FBS (Bioindustry) f'37 ° C.u 5% CO2.
RNA ġie estratt minn 1 × 107 trophozoites f'1 ml ta 'reaġent TRIzol (Vazyme, Nanjing, iċ-Ċina), DNA ġenomika ġie estratt minn G. duodenalis RNA totali bl-użu ta' MonScript dsDNase (Monad, Wuhan, China) u DNA komplementari (cDNA) ġie sintetizzat billi tuża MonScript RTIIII Super Mix (Monad) skont l-istruzzjonijiet tal-manifattur.
Informazzjoni dwar is-sekwenza CDS għall-ġene G. duodenalis fil-mira nkisbet mill-NCBI GenBank.Uża Primer 5.0 biex tfassal primers ta' klonazzjoni bla saldaturi speċifiċi għal kull ġene fil-mira.Il-primer quddiem (5′-3′) jikkonsisti fi tliet partijiet: sekwenza li tikkoinċidi b'vettur linearizzat pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) u kodoni tal-bidu ATG u GNN (jekk l-ewwel bażi mhix G).Dan isir biex tittejjeb l-effiċjenza tal-espressjoni.Barra minn hekk, mill-inqas 16 bp bażi magħquda (kontenut GC 40-60%/Tm madwar 55 °C).Il-primer invers (5′-3′) jikkonsisti f'żewġ partijiet, sekwenza li tikkoinċidi b'vettur linearizzat EcoRV pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) u bażi magħquda ta' mill-inqas 16 bp.(esklużi l-aħħar żewġ waqfiet).bażijiet) kodon bħal AA jew GA biex il-plażmidi rikombinanti jkunu jistgħu jesprimu l-proteini ttikkettjati tagħhom).Is-sekwenzi tal-primer huma elenkati fit-Tabella 1 u ġew sintetizzati minn Kangmet Biotechnology Co., Ltd. (Changchun, iċ-Ċina).
Il-miri ġew amplifikati bl-użu ta 'Pfu DNA polymerase (Tiangen, Beijing, iċ-Ċina) jew Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co., Ltd., Beijing, China) bl-użu ta' cDNA ppreparat G. duodenalis bħala mudell.Il-plasmid tal-vettur tal-espressjoni ewkarjotika pcDNA3.1(+) kien linearizzat bl-enzima ta 'restrizzjoni EcoRV u defosforilat bl-użu ta' Fast AP (Thermo Fisher Scientific).Frammenti pcDNA3.1(+) linearizzati u frammenti tal-ġeni fil-mira amplifikati ġew ippurifikati bl-użu ta 'kitt ta' purifikazzjoni tal-ġel tad-DNA (Tiangen) u kkwantifikati bl-użu ta 'Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).Il-framment pcDNA3.1(+) u kull framment tal-ġene fil-mira ġew rikombinati bl-użu ta 'taħlita ta' klonazzjoni ta 'assemblaġġ wieħed MonClone (Monad Biotech Co., Ltd., Suzhou, China) u kkonfermati permezz ta' sekwenzar tad-DNA bl-użu ta 'Comate Bioscience Company Limited (Changchun, Ċina)..
Plasmidi ħielsa minn endotossini pcDNA3.1(+)-alpha-2 u pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ġew iġġenerati bl-użu tal-Plasmid Mini Kit SanPrep Endotoxin-free (Sangon Biotech).Il-konċentrazzjoni nżammet 'il fuq minn 500 ng/µl biex jiġi żgurat li l-EDTA fil-buffer tal-eluzzjoni ma jinterferixxix mal-assaġġ tat-trasfezzjoni.Makrofaġi peritoneali tal-ġurdien primarji ġew ikkultivati ​​fi pjanċi ta '6-well b'medja RPMI 1640 kompluta (Industriji Bijoloġiċi) għal 12-il siegħa, imbagħad iċ-ċelloli ġew maħsula 3 darbiet f'PBS sħun biex jitneħħew il-peniċillina u streptomycin, u mbagħad f'medja supplimentata b'medja kompluta.Plażmidi ħielsa minn endotossini pcDNA3.1(+)-alpha-2 u pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (2.5 μg) ġew dilwiti f'125 μl ta 'mezz tas-serum ridott Opti-MEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific)..Imbagħad 5 µl ta’ reaġent ta’ trasfezzjoni Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) ġew dilwiti f’125 µl ta’ medium Opti-MEM fis-serum baxx.Ipprepara kumplessi liposomi-DNA billi tħallat il-plasmid dilwit mingħajr endotossini ma' Lipofectamine 2000 u ħalli t-taħlita toqgħod f'temperatura ambjentali għal 5 minuti.Ittrasferixxi l-kumplessi separatament għal ċelloli f'kull bir u ħallat bil-mod.Wara 4 sigħat, il-mezz tal-kultura taċ-ċelluli ġie sostitwit b'2 ml ta' medju RPMI 1640 komplut u l-kultura kompliet għal 24 siegħa.Medju frisk tal-kultura taċ-ċelluli ġie miżjud maċ-ċelloli u inkubat għal diversi punti ta 'żmien skont id-disinn tal-assaġġ.
Kampjuni ta 'proteini minn supernatanti u lisati taċ-ċelluli ġew ippreparati kif deskritt qabel [25].Il-parametri tat-trasferiment tal-membrana għal pro-IL-1β, pro-caspase-1, caspase-1 p20, NLRP3, β-actin, u His-tag kienu 200 mA/90 min.Għall-interleukin 1β (IL-1β; Sistemi R&D, Minneapolis, Minnesota, USA), caspase-1 (p20) (Adipogen, l-Isvizzera) u NLRP3 (Adipogen SA, Epalinges, l-Isvizzera) u 1:5000 immirati It-tikketta tiegħu ( Amylet Scientific, Wuhan, iċ-Ċina) u β-actin (Proteintech, Wuhan, iċ-Ċina).
Cross-linking ma 'disuccinimide suberate (DSS) sar kif deskritt qabel [26].Iċ-ċelloli ġew maħsula 3 darbiet b'PBS kiesaħ u kompletament lysed b'labra 27 gauge f'50 µl buffer ta 'reazzjoni ASC (pH 8.0) li kien fih 25 mM Na2PO4, 187.5 mM NaCl, 25 mM HEPES u 125 mM NaHCO3.It-taħlita ġiet ċentrifugata f'5000 g għal 3 min u l-pellet ġie suturat b'10 µl DSS (25 mM f'DMSO) u 40 µl buffer ta' reazzjoni ASC għal 30 min f'37°C.Wara ċentrifugazzjoni f'5000 g għal 10 min, il-pellet ġie maħlul f'soluzzjoni ta '40 µl ta' buffer ta 'reazzjoni ASC u 10 µl ta' buffer ta 'tagħbija ta' proteini 6x (TransGen, Beijing, China), u mbagħad is-soluzzjoni ġiet imkessħa f'temperatura tal-kamra għal 15. min., Imbagħad għalli 10 minuti.Kampjuni ta 'proteini mbagħad ġew soġġetti għal Western blotting bl-użu ta' antikorpi anti-ASC primarji (Wanleibio, Shenyang, iċ-Ċina) fi proporzjon ta 'dilwizzjoni ta' 1:500.
Wara proċedura deskritta qabel [13], inħasdu supernatanti tal-kultura taċ-ċelluli u s-sekrezzjoni taċ-ċitokin pro-infjammatorju IL-1β ġiet iddeterminata bl-użu tal-kit IL-1 Beta ELISA tal-ġurdien (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific).Ikkonverti l-valuri OD450nm għal konċentrazzjonijiet ta 'proteini billi tuża l-kurva standard IL-1β.
Ċelloli miksija fuq coverslips ġew maħsula bil-mod 3 darbiet f'PBS sħun, iffissati f'fissattiv taċ-ċelluli tat-tessuti (Biosharp, Beijing, iċ-Ċina) għal 10 minuti f'temperatura tal-kamra (RT), f'0.1% Triton X-Permeabilize f'100 (dilwit f'PBS; Biosharp; ) għal 20 minuta f'temperatura ambjentali u jimblokka f'5 % albumina tas-serum bovin (f'PBS) għal sagħtejn f'temperatura ambjentali.Iċ-ċelloli mbagħad ġew inkubati matul il-lejl f'4 ° C b'antikorpi primarji kontra ASC (dilwizzjoni 1:100) jew NLRP3 (dilwizzjoni 1:100), rispettivament, u mogħoż tikkettat Cy3 kontra l-fenek IgG (H + L) (1:400; EarthOx , San Francisco, CA, USA) jew mogħoż konjugat FITC kontra l-ġurdien IgG (1:400; Earthox) matul il-lejl f'37 ° C fid-dlam għal siegħa.In-nuklei kienu mtebbgħin b'Hoechst 33258 (10 μg/ml; UE, Suzhou, iċ-Ċina) għal 5 minuti u osservati taħt mikroskopju fluworexxenti (Olympus Corporation, Tokyo, Ġappun).
Il-ġrieden kienu maqsuma f'erba 'gruppi (n = 7 f'kull grupp): (i) Grupp ta' kontroll negattiv trattat b'PBS (PBS biss; gavage 100 µl/ġurdien PBS segwit minn injezzjoni intraperitoneali kuljum 100 µl/ġurdien PBS 3 sigħat wara)., kontinwament għal 7 ijiem);(ii) grupp ta 'kontroll negattiv trattat b'inibitur MCC950 [27] (100 µl/ġurdien permezz ta' gavage PBS, 3 sigħat wara, 10 mg/kg piż tal-ġisem [BW] MCC950 [f'PBS] ingħata intraperitoneally kuljum, tul 7 ijiem);(iii) Grupp ta 'infezzjoni taċ-ċisti G. duodenalis (1.5 x 106 ċisti/ġurdien permezz ta' gavage, 3 sigħat wara, 100 μl/ġurdien PBS intraperitonealment amministrat kuljum għal 7 ijiem);(iv) Ċisti G. duodenalis grupp ta 'infezzjoni magħquda grupp ta' trattament ta 'inibitur MCC950 (1.5 × 106 ċisti / ġurdien permezz ta' gavage, 10mg / kg piż tal-ġisem MCC950 intraperitonealment kuljum għal 7 ijiem fi 3h).Il-piż tal-ġisem ta 'kull ġurdien ġie mmonitorjat kuljum u l-ġrieden kollha ġew ewtanizzati fis-7 jum.Duwodenu maħsud (tul 3 ċm) inqatgħet f'biċċiet żgħar f'1 ml PBS, ċisti ġew meqruda matul il-lejl f'PBS f'4 ° C, u trofozoiti G. duodenalis.Duwodenu frisk (1 ċm twil) kien iżolat għat-tbajja ta' ematossilin u eosina (H&E).
Il-ġrieden kienu maqsuma f'żewġ gruppi: (i) grupp ta 'kontroll MOCK u (ii) grupp ta' inibitur MCC950.Kien hemm ħames trattamenti f'kull grupp (n = 7/grupp ta 'trattament): (i) grupp ta' kontroll negattiv ta 'trattament PBS (PBS biss; 100 µl / ġurdien PBS, injezzjoni intramuskolari (IM) (tibialis anterior) [28, 29] ;( ii) grupp ta' kontroll negattiv tal-plasmid pcDNA3.1(+) (100 µg/DNA tal-ġrieden, permezz ta' injezzjoni ġol-muskoli) (iii) grupp ta' kontroll pożittiv ta' infezzjoni taċ-ċisti G. duodenalis (1.5 x 106 ċisti/ġurdien, permezz ta' gavage) (iv) a); grupp ittrattat bil-plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 μg/marieden DNA, b'injezzjoni ġol-muskoli), u (v) grupp trattat bil-plasmid pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 µg/mause DNA, wara 12-il siegħa ta 'passaġġ, ġrieden fil-grupp ta' inibitur MCC950 irċevew injezzjoni intraperitoneali ta 'kuljum ta' MCC950 (10 mg / kg piż tal-ġisem) għal 7 ijiem, filwaqt li ġrieden fil-grupp MOCK irċevew volum ugwali ta 'trattament PBS. Kampjuni tad-demm kienu miġbura mill-ġrieden tal-għajnejn u tħallew matul il-lejl f'4 °C kampjuni tas-serum ġew iżolati bl-użu ta 'assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi (ELISA) għal u kejl tal-livelli ta 'IL-1β.
Ħamsa u tletin ġrieden ġew maqsuma f'ħames gruppi (n=7/grupp).Grupp 1 kien grupp ta 'kontroll negattiv trattat b'PBS: il-ġrieden irċevew 100 μl ta' PBS ġol-muskoli u 3 ijiem wara permezz ta 'gavage.Grupp 2 huwa grupp ta 'kontroll pożittiv infettat b'ċisti G. duodenalis: ġrieden ġew injettati b'100 μl ta' PBS, u 3 ijiem wara 1.5 x 106 ċisti / ġurdien ġew injettati intragastrikament.It-tielet grupp - immunizzazzjoni tal-plasmid b'pcDNA3.1(+) flimkien ma' grupp ta' kontroll għall-infezzjoni taċ-ċisti duwodenali: il-ġrieden irċevew 100 μg ta' DNA plasmid pcDNA3.1(+)(im) oralment, 1.5×106 ċisti/maws 3 għal diversi jiem.Gruppi 4 u 5 kienu rikombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine plasmid jew pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine plasmid flimkien ma 'infezzjoni taċ-ċisti G. duodenalis.Grupp sperimentali: ġrieden irċevew 100 µg ta’ pcDNA3.1(+)-giardine plasmid DNA (im), imbagħad 3 ijiem wara, 1.5 × 106 ċisti/ġurdien ġew injettati permezz ta 'gavage.Il-piż tal-ġisem ta 'kull ġurdien ġie mmonitorjat wara l-introduzzjoni taċ-ċisti G. duodenalis mit-tubu.Inġabar duwodenu frisk għal kejl tat-tagħbija parassitika u analiżi tat-tbajja 'HE.
Bidliet istopatoloġiċi ġew analizzati skont proċedura ppubblikata qabel [30].Duwodenu frisk ġie ffissat b'fissattiv taċ-ċelluli tat-tessuti, inkorporat fil-paraffin, maqtugħ f'sezzjonijiet ta '4 μm, imtebba b'H & E u analizzat taħt mikroskopju tad-dawl.Bidliet patoloġiċi rappreżentattivi f'seba 'taqsimiet tat-tessuti minn seba' ġrieden indipendenti ġew evalwati minn patologu li ma kienx jaf bit-trattament u nqabdu b'ingrandiment ta '200x.It-tul tal-villi u l-fond tal-kripti ġew imkejla skont il-metodi deskritti qabel.
Ir-riżultati in vitro u in vivo nkisbu fi tliet kopji.Grafiċi ġew iġġenerati bl-użu ta 'GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA).Id-differenzi bejn żewġ gruppi ġew analizzati bit-test t, filwaqt li d-differenzi bejn ≥3 gruppi ġew analizzati b'analiżi one-way ta 'varjanza (ANOVA) bl-użu ta' softwer SPSS (verżjoni 22.0; SPSS IBM Corp., Armonk, NY, USA).Id-dejta ġiet analizzata għall-omoġeneità tal-varjanza bl-użu tat-test ta' Levene segwit mit-test post hoc ta' Bonferroni (B).Is-sinifikat huwa espress bħala P<0.05, P<0.01, u P<0.001 (mhux sinifikanti [ns]) (P>0.05).
L-analiżi preċedenti tagħna tal-proteomika GEV fl-Enċiklopedija ta 'Kyoto tal-Ġeni u l-Ġenomi (KEGG) uriet li ħafna miri jistgħu jkunu involuti fl-attivazzjoni ta' mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni infjammatorja [13].Aħna għażilna żewġ miri promettenti, alpha-2 u alpha-7.3 giardins, namplifikaw dawn il-molekuli u nużawhom biex nibnu l-vettur tal-espressjoni ewkarjotiku pcDNA3.1(+).Wara s-sekwenzjar, plasmidi ta' espressjoni ta' pcDNA3.1(+)-alpha-2 u alpha-7.3 giardine rikombinanti ġew trasfettati f'makrofaġi peritoneali tal-ġurdien primarji, u ġiet identifikata l-proteina tal-firma ta' infjammazzjoni caspase-1 p20 (framment ta' caspase-1 attivat) bħala molekuli ewlenin li jispjegaw li jistgħu jikkawżaw infjammazzjoni.Ir-riżultati wrew li alpha-2 u alpha-7.3 giardines jistgħu jinduċu espressjoni p20 caspase-1 simili għal GEV.L-ebda effett fuq l-attivazzjoni ta 'caspase-1 ma nstab fil-kontroll negattiv mhux ittrattat (PBS biss) u l-kontroll tal-plasmid pcDNA3.1(+) (Figura 1).
Kejl ta 'p20 caspase-1 attivazzjoni minn pcDNA3.1(+)-alpha-2 u alpha-7.3 giardins.Plażmidi ta' espressjoni ewkarjotika rikombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 u alpha-7.3 giardines (fuq kull korsija) ġew trasfettati f'makrofaġi peritoneali tal-ġrieden primarji u s-supernatanti tal-kultura nħasdu 24 siegħa wara.Western blotting intuża biex ikejjel il-livelli ta 'espressjoni tal-proteina inflammasome caspase-1 p20 tal-firma.Il-grupp ta 'trattament PBS biss (korsija C) u l-grupp ta' monoterapija pcDNA3.1(+) (korsija pcDNA3.1) intużaw bħala kontroll negattiv, u l-grupp ta 'trattament GEV intuża bħala kontroll pożittiv.L-espressjoni tal-proteina rikombinanti ġiet ikkonfermata billi nstab tikketta histidine f'kull proteina, u l-meded ta 'proteini mistennija kienu alpha-2 giardine (38.2 kDa) u alpha-7.3 giardine (37.2 kDa).GEV, vesikuli extraċellulari Giardia duodenum, pcDNA3.1(+), vettur linearizzat EcoRV, SUP, supernatant
Biex tiddetermina jekk alpha-2 giardine u alpha-7.3 giardine jinduċux espressjoni p20 caspase-1 u għandhom rwol fl-attivazzjoni tar-rispons infjammatorju NLRP3 ospitanti, pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine u pcDNA3.1(+)-alpha -7.3 giardin ġie trasfettat f'makrofaġi peritoneali tal-ġurdien primarji b'DNA tal-plasmid rikombinanti, u ġew determinati livelli ta 'espressjoni, lokalizzazzjoni u oligomerizzazzjoni tal-proteini infjammatorji ewlenin NLRP3.F'dan l-esperiment, GEV intuża bħala l-grupp ta 'kontroll pożittiv, u l-grupp ta' l-ebda trattament (PBS biss) jew il-grupp ta 'trattament ta' trasfezzjoni pcDNA3.1(+) kien il-grupp negattiv.Ir-riżultati wrew li, bħal fil-grupp GEV, DNA plasmid rikombinanti ta 'giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 u giardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 irriżulta f'regolazzjoni 'l fuq ta' NLRP3, pro-IL-1β u attivazzjoni procaspase-1 u caspase-1 (Fig. 2a).Barra minn hekk, iż-żewġ giardine indoxxew sekrezzjoni sinifikanti ta 'IL-1β (pcDNA3.1: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.1000; alpha-2 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0007 ).;alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P <0.0001;GEV: ANOVA, F (4, 10) = 1.625, P = 0.0047) (Figura 2b).Il-biċċa l-kbira tal-proteini ASC kienu monomeriċi fil-grupp mingħajr trattament jew fil-grupp ta 'trattament trasfettat bil-plasmid pcDNA3.1(+), b'kuntrast ma' pcDNA3.1(+)-alpha-2 jew pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 giardine.Oligomerizzazzjoni ASC seħħet fid-DNA tal-plasmid rikombinanti tal-grupp jew grupp ta 'kontroll pożittiv GEV, li turi forma oligomerika (Figura 2c).Din id-dejta preliminari tissuġġerixxi li alpha-2 giardine u alpha-7,3 giardine jistgħu jinduċu l-attivazzjoni tal-infjammazzjoni NLRP3.Studji sussegwenti immunofluworexxenti tal-lokalizzazzjoni ta 'ASC u NLRP3 wrew li fil-grupp ta' kontroll negattiv, il-proteina ASC kienet imxerrda maċ-ċitoplasma kollha u dehret bħala sinjal ta 'tikek fuq stimulazzjoni ta' pcDNA3.1(+)-alpha-2 b'giardine jew pcDNA3.Grupp 1(+)-alpha-7,3 giardine jew grupp ta 'kontroll pożittiv GEV (Figura 2d).Fil-gruppi ta’ pcDNA 3.1 ta’ kontroll negattiv u ttrattati bil-plasmid, is-sinjal tal-proteina NLRP3 ma ġiex skopert, filwaqt li tikka ta’ sinjal fluworexxenti bi tweġiba għal pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine jew pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 ġiet skoperta..giardine jinstabu fiċ-ċitoplasma jew mal-istimulazzjoni tal-HEV (Fig. 2e).Din id-dejta turi wkoll li G. duodenalis giardin alpha-2 u giardin alpha-7.3 jattivaw l-inflammasome NLRP3 fil-makrofaġi peritoneali primarji tal-ġrieden.
pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin u pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin jattivaw l-inflammasome NLRP3 fil-makrofaġi peritoneali tal-ġurdien.Ittrasfetta l-plażmidi ta’ espressjoni ewkarjotika rikombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin u pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin f’makrofagi u ċelloli peritoneali tal-marieni primarji, jew aħsad is-supernatant fi żmien 24 siegħa għall-analiżi tal-espressjoni, oligomerizzazzjoni , sekrezzjoni.u lokalizzazzjoni ta 'proteini infjammatorji ewlenin.Il-grupp PBS-biss (C) u l-grupp ta 'trattament uniku pcDNA3.1(+) intużaw bħala l-kontroll negattiv, u l-grupp ta' trattament GEV intuża bħala l-grupp pożittiv.a Proteini infjammatorji ewlenin NLRP3, inklużi NLRP3, pro-IL-1β, pro-caspase-1, u p20 caspase-1, ġew skoperti minn Western blotting.b Il-livelli ta 'sekrezzjoni ta' IL-1β fis-supernatanti ġew determinati bl-użu ta 'assaġġ immunosorbenti marbut ma' enzimi (ELISA).Id-differenzi bejn il-gruppi ta 'kontroll u dawk sperimentali ġew analizzati permezz ta' analiżi one-way ta 'varjanza (ANOVA) bl-użu ta' softwer SPSS verżjoni 22.0.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bejn il-gruppi **P<0.01 u ***P<0.001.c Il-livelli ta 'oligomerizzazzjoni ASC fil-gerbub ġew determinati permezz ta' analiżi ta 'cross-linking DSS, filwaqt li l-livelli ASC f'lisati taċ-ċelluli ntużaw bħala kontroll tat-tagħbija.d Viżwalizzazzjoni tal-lokalizzazzjoni tal-ISC bl-użu tal-immunofluworexxenza.e L-immunofluworexxenza ntużat biex tiġi viżwalizzata l-lokalizzazzjoni ta 'NLRP3.ASC, proteina apoptotika bħal speck;IL, interleukin;NLRP3, riċettur 3 li jixbah l-oligomerizzazzjoni li jgħaqqad nukleotidi;ns, mhux sinifikanti (P ​​> 0.05)
Kemm G. duodenalis kif ukoll il-GEVs li joħroġ jattivaw l-inflammasome NLRP3 u jirregolaw ir-risponsi infjammatorji tal-host in vitro.Għalhekk, ir-rwol tal-inflammasome NLRP3 fil-patoġeniċità ta 'G. duodenalis għadu mhux ċar.Biex tinvestiga din il-kwistjoni, iddisinja esperiment bejn ġrieden infettati b'ċisti G. duodenalis u ġrieden infettati b'ċisti G. duodenalis + trattament ta 'inibitur MCC950 u qabblu l-espressjoni inflammasome NLRP3 meta infettati b'ċisti G. duodenalis.Skema dettaljata ta 'l-esperiment hija murija fil-Fig. 3a.Bidliet fil-piż tal-ġisem tal-ġrieden fi gruppi ta 'trattament differenti ġew immonitorjati għal 7 ijiem wara l-infezzjoni biċ-ċisti, u r-riżultati huma murija f'Fig. 3b.Meta mqabbel mal-grupp ittrattat b'PBS pur, ir-riżultati wrew li (i) il-piż tal-ġisem tal-ġrieden infettati b'ċisti G. duodenalis naqas minn jum 3 sa jum 7 wara l-infezzjoni;(ii) trattament bl-inibitur MCC950 ma kellu l-ebda effett sinifikanti fuq il-piż tal-ġisem tal-ġrieden..Meta mqabbel mal-grupp ta' infezzjoni waħda, il-BW tal-grupp ta' infezzjoni duwodenali trattat b'MCC950 naqas fi gradi differenti (Jum 1: ANOVA, F(3, 24) = 1.885, P = 0.0148; Jum 2: ANOVA, F (3, 24) ) = 0.4602, P<0.0001: ANOVA, F(3, 24) = 0.8360, P = 0.0010: ANOVA, F (3, 24) = 1.683, P = 0.0052; (3, 24)=0.6497, P=0.0645; Jum 6: ANOVA, F(3, 24)=5.457, P=0.0175: ANOVA, F(3, 24) = 2.893, P = 0.0202;Din id-dejta turi li l-inflammasome NLRP3 jipproteġi l-ġrieden minn telf ta 'piż sinifikanti fl-istadji bikrija (2-4 ijiem) ta' infezzjoni duwodenali.Imbagħad immiraw li niskopru G. duodenalis trophozoites fil-fluwidu tal-ħasil duwodenali u r-riżultati huma murija fil-Figura 3c.Meta mqabbel mal-grupp ta 'infezzjoni taċ-ċisti G. duodenalis, in-numru ta' trofozoiti fid-duwodenu żdied b'mod sinifikanti wara li mblokka l-inflammasome NLRP3 (t (12) = 2.902, P = 0.0133).Tessuti duwodenali mtebbgħin b'HE wrew, meta mqabbla ma 'kontroll negattiv ikkurat b'PBS u MCC950 waħdu: (i) infezzjoni taċ-ċisti G. duodenalis irriżulta f'ħsara lill-villi duwodenali (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0488 ) u atrofija tal-kripto (ANOVA, F(3, 24) = 0.4716, P = 0.0089);(ii) duwodenu minn ġrieden infettati b'ċisti G. duodenalis u kkurati b'inibituri MCC950.villi duwodenali kienu bil-ħsara u mejta (ANOVA, F (3, 24) = 0.4903, P = 0.0144) b'atrofija u fergħat kripta (ANOVA, F (3, 24) = 0.4716, P = 0, 0481) (Fig. 3d- f) .Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-inflammasome NLRP3 għandu rwol fit-tnaqqis tal-patoġeniċità ta 'G. duodenalis.
Rwol ta 'NLRP3 inflammasome fl-infezzjoni tad-duwodenu Giardia.Ġrieden ġew gavaged (iv) ma 'ċisti duodenococcal u mbagħad ittrattati bi jew mingħajr MCC950 (ip).Gruppi ta' trattament wieħed b'PBS jew MCC950 intużaw bħala kontrolli.Grupp sperimentali u kors ta 'trattament.b Il-piż tal-ġisem tal-ġrieden f'kull wieħed mill-gruppi ta' trattament varji ġie mmonitorjat għal 7 ijiem.Id-differenza bejn il-grupp ta 'infezzjoni ta' G. duodenalis u l-grupp ta 'trattament ta' infezzjoni ta 'G. duodenalis + MCC950 ġiet analizzata permezz tat-test bl-użu ta' softwer SPSS verżjoni 22.0.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti f'*P<0.05, **P<0.01, jew ***P<0.001.c It-tagħbija parassitika ġiet iddeterminata billi jingħadd in-numru ta 'trofozoites fil-fluwidu tal-ħasil duwodenali.Id-differenza bejn il-grupp ta 'infezzjoni ta' G. duodenalis u l-grupp ta 'trattament ta' infezzjoni ta 'G. duodenalis + MCC950 ġiet analizzata permezz tat-test bl-użu ta' softwer SPSS verżjoni 22.0.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti f'*P < 0.05.d Riżultati tat-tbajja ta' ematossilin u eosina (H&E) ta' l-istopatoloġija duwodenali.Il-vleġeġ ħomor jindikaw ħsara lill-villi, il-vleġeġ ħodor jindikaw ħsara lill-kripti.Skala bar: 100 µm.e, f Analiżi statistika tal-għoli tal-villus duwodenali u l-għoli tal-kripta tal-ġurdien.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti f'*P<0.05 u **P<0.01.Ir-riżultati huma meħuda minn 7 esperimenti bijoloġiċi indipendenti.BW, piż tal-ġisem;ig, rotta tal-kunsinna intragastrika;ip, rotta tal-kunsinna intraperitoneali;ns, mhux sinifikanti (P ​​> 0.05);PBS, phosphate buffered saline;WT, tip selvaġġ
Is-sekrezzjoni ta 'IL-1β hija karatteristika ta' attivazzjoni ta 'infjammazzjoni.Biex tiddetermina jekk G. duodenalis alpha-2 giardine u alpha-7.3 giardine jattivawx l-inflammasome ospitanti NLRP3 in vivo, użajna ġrieden WT mhux ittrattati (grupp ta 'sham) u ġrieden imblukkati bl-inflammasome NLRP3 (grupp ta' trattament inibit MCC950).Skema dettaljata ta 'l-esperiment hija murija fil-Fig. 4a.Gruppi sperimentali kienu jikkonsistu minn ġrieden ittrattati b'PBS, trattament taċ-ċisti G. duodenalis permezz ta 'gavage, injezzjoni ġol-muskoli ta' pcDNA3.1, u injezzjoni ġol-muskoli ta 'pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine jew pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine.Fis-7 jum wara l-għoti ġol-muskoli tal-plasmid rikombinanti, inġabar is-serum u ġie ddeterminat il-livell ta 'IL-1β f'kull grupp.Kif muri fil-Figura 4b, fil-grupp MOCK: (i) meta mqabbel mal-grupp PBS, it-trattament ta 'pcDNA3.1 ma kellu l-ebda effett sinifikanti fuq is-sekrezzjoni ta' IL-1β (ANOVA, F (4.29) = 4.062, P = 0.9998), madankollu, Is-sekrezzjoni ta 'IL-β kienet elevata b'mod sinifikanti fil-grupp taċ-ċisti G. duodenalis (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P = 0.0002), (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine u pcDNA3.1- Injezzjoni intramuskolari ta 'alpha-7.3 giardine żiedet b'mod sinifikanti l-livelli ta' IL-1β fis-serum (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P <0.0001);(iii) pcDNA3.1-alpha-7,3 giardine indotta livelli għoljin ta 'sekrezzjoni ta' IL -1β fil-grupp ta 'injezzjoni intramuskolari ta' pcDNA3.1-alpha-2 giardine (ANOVA, F (4, 29) = 4.062, P = 0.0333) .Meta mqabbel ma 'kull grupp fil-grupp ta' trattament MCC950 u l-grupp MOCK: (i) Il-livelli ta 'sekrezzjoni ta' IL-1β fil-grupp ta 'kontroll PBS u l-grupp ta' kontroll pcDNA3.1 naqsu sa ċertu punt wara li mblukkaw l-inibitur MCC950, iżda d-differenza ma kinitx sinifikanti (PBS: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.5949);(ii) wara li jimblokka MCC950., Is-sekrezzjoni ta 'IL-1β tnaqqset b'mod sinifikanti fil-grupp infettat biċ-ċisti G. duodenalis, il-grupp pcDNA3.1-alpha-2 giardine, u l-grupp pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine (G. duodenalis: ANOVA, F(9) , 58) = 3.540, P = 0.0120 pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F (9, 58) = 3.540, P = 0.0447 pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (9, 58); ) = 3.540, P = 0.0164).Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li alpha-2 giardine u alpha-7.3 giardine jimmedjaw l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 in vivo.
pcDNA3.1(+)-giardines jattivaw l-inflammasome ospitanti NLRP3 in vivo.Il-ġrieden ġew immunizzati (IM) bi plasmid ta' espressjoni ewkarjotika rikombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine jew pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine u mbagħad ittrattati b'MCC950 (ip; grupp MCC950) jew le (grupp finta ).Il-grupp ta 'trattament tal-plasmid PBS jew pcDNA3.1(+) intuża bħala kontroll negattiv, il-grupp ta' trattament taċ-ċisti G. duodenalis intuża bħala kontroll pożittiv.Grupp sperimentali u kors ta 'trattament.b Il-livelli tas-serum ta' IL-1β fil-ġrieden ġew imkejla f'jum 7 permezz ta' analiżi ELISA.Id-differenzi bejn il-gruppi fil-grupp MOCK ġew analizzati bl-użu ta 'ANOVA one-way, u d-differenzi bejn il-grupp MOCK u l-grupp MCC950 ġew analizzati bl-użu tat-test t tal-verżjoni tas-softwer SPSS 22.0.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bejn il-gruppi ta 'trattament fil-grupp MOCK, *P<0.05 u ***P<0.001;sinjali tad-dollaru ($) jindikaw differenzi sinifikanti bejn kull grupp fil-grupp MOCK u l-grupp MCC950 f'P<0.05.Riżultati ta 'seba' esperimenti bijoloġiċi indipendenti....i, injezzjoni ġol-muskoli, ns, mhux sinifikanti (P ​​> 0.05)
Biex tinvestiga l-effett tal-attivazzjoni medjata minn alpha-2 u alpha-7.3 giardine tal-inflammasome ospitanti NLRP3 fuq l-infettività ta 'G. duodenalis, użajna ġrieden WT C57BL / 6 u injettajna alpha-2 giardine u alpha-7.3 giardine.il-plasmid ġie injettat ġol-muskoli, wara 3 ijiem mit-tubu gastriku taċ-ċisti G. duodenalis, wara li l-ġrieden ġew osservati għal 7 ijiem.Skema dettaljata tal-esperiment hija murija fil-Fig. 5a.Il-piż tal-ġisem ta 'kull ġurdien kien imkejjel kuljum, kampjuni ta' tessut duwodenali frisk inġabru fis-7 jum wara l-amministrazzjoni permezz ta 'tubu gastriku, in-numru ta' trofozoiti ġie mkejjel, u ġew osservati bidliet istopatoloġiċi.Kif muri fil-Figura 5b, biż-żieda fil-ħin tat-tmigħ, il-BW tal-ġrieden f'kull grupp żdied gradwalment.L-MT tal-ġrieden bdew jonqsu fit-3 jum wara l-għoti intragastriku ta 'ċisti G. duodenalis, u mbagħad żdiedu gradwalment.L-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 indotta minn injezzjoni ġol-muskoli ta 'alpha-2 giardine u alpha7.3 giardine attenwat b'mod sinifikanti t-telf ta' piż fil-ġrieden (Jum 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 1.399, P = 0 .9754 Jum 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30)=1.399, P=0.9987 Jum 2: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.3172, P = 0.9979; Jum 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.3172, P = 0.8409: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA; 4, 30) = 0.8222, P = 0.0262 Jum 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4 , 30) = 0.8222, P = 0.0083 Jum 4: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA , F (4, 30) = 0.5620, P = 0.0012, Jum 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.5620, P < 0.0001, Jum 5: pcDNA3.1-alpha - 2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Jum 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.9728, P < 0.0001 Jum 6: pcDNA3 .1 - alpha-2 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0012, Jum 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F (4, 30) = 0.7154, P = 0.0006;Jum 7: pcDNA3.1-alpha-2 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P<0.0001 Jum 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine, ANOVA, F(4, 30) = 0.5369, P <0.0001).It-tagħbija parassitika ġiet evalwata fid-duwodenu (Fig. 5c).Meta mqabbel mal-kontroll pożittiv mhux ittrattat u l-grupp injettat bil-vettur pcDNA3.1 vojt, in-numru ta 'trophozoites G. duodenalis kien imnaqqas b'mod sinifikanti fil-gruppi injettati b'α-2 giardine u α-7,3 giardine (pcDNA3.1-alpha -2 giardine : ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0002, pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P <0.0001).Barra minn hekk, giardine alfa-7.3 kien aktar protettiv fil-ġrieden minn giardine alfa-2 (ANOVA, F (3, 24) = 1.209, P = 0.0081).Ir-riżultati tat-tbajja 'HE huma murija fil-fig.5d–f.Ġrieden injettati b'alpha-2 giardine u alpha-7.3 giardine kellhom inqas leżjonijiet fit-tessut duwodenali, manifestati minn ħsara fil-villus, meta mqabbla ma 'ġrieden injettati b'G. duodenalis u ġrieden injettati b'G. duodenalis flimkien ma' vettur pcDNA3 vojt .1 Zoom.(pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 2.466, P = 0.0035 jew P = 0.0068; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA, F (3, 24) = 2.466, P = 0.0028 jew P = 0.0055) u atrofija tal-kripto mnaqqsa (pcDNA3.1-alpha-2 giardine: ANOVA, F(3, 24) = 1.470, P = 0.0264 jew P = 0.0158; pcDNA3.1-alpha-7.3 giardine: ANOVA , F (3, 24) = 1.470, P = 0.0371 jew P = 0.0191).Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li alpha-2 giardine u alpha-7,3 giardine inaqqsu l-infettività ta 'G. duodenalis billi jattivaw l-inflammasome NLRP3 in vivo.
Rwol ta 'pcDNA3.1(+)-giardins fl-infezzjoni ta' G. duodenalis.Ġrieden ġew immunizzati (IM) bi plasmidi ta 'espressjoni ewkarjotika rikombinanti pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine jew pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine u mbagħad ikkontestati b'ċisti G. duodenalis (ig).Il-grupp PBS u l-grupp ta 'trattament taċ-ċisti duwodenali pcDNA3.1(+) + intużaw bħala gruppi ta' kontroll negattiv, u l-grupp ta 'trattament taċ-ċisti duwodenali intuża bħala grupp ta' kontroll pożittiv.Grupp sperimentali u kors ta 'trattament.b L-MT tal-ġrieden f'kull wieħed mill-gruppi ta' trattament varji ġie mmonitorjat għal 7 ijiem wara l-isfida.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti bejn il-gruppi fil-grupp G. duodenalis u l-grupp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, *P <0.05, **P <0.01, u ***P <0.001;is-sinjal tad-dollaru ($) jindika differenza sinifikanti bejn kull grupp ta 'G. duodenalis u l-grupp pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine, $$P<0.01 u $$$P<0.001.c Tagħbija parassitika ġiet iddeterminata billi jingħaddu n-numru ta 'trofozoites f'1 ml ta' lavage duwodenali mid-duwodenu (3 ċm twil) u espress bħala n-numru ta 'parassiti għal kull ċm ta' duwodenu.Id-differenzi bejn il-grupp ta 'infezzjoni G. duodenalis, il-grupp pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine, u l-grupp pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine ġew analizzati b'ANOVA one-way bl-użu ta' softwer SPSS verżjoni 22.0.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti f'**P<0.01 u ***P<0.001.d Bidliet istopatoloġiċi fid-duwodenu.Il-vleġeġ ħomor jindikaw ħsara lill-villi, il-vleġeġ ħodor jindikaw ħsara lill-kripti.Skala bar: 100 µm.e, f Analiżi statistika tal-għoli tal-villus duwodenali tal-ġurdien (e) u l-għoli tal-kripta (f).Id-differenzi bejn il-gruppi fil-Figura 1d ġew analizzati b'ANOVA one-way bl-użu tas-softwer SPSS verżjoni 22.0.L-asterisks jindikaw differenzi sinifikanti f'*P<0.05 u **P<0.01.Riżultati ta 'seba' esperimenti bijoloġiċi indipendenti....ns, mhux sinifikanti (P ​​> 0.05)
Giardia duodenum huwa parassita intestinali magħruf tal-bnedmin u mammiferi oħra li jikkawża ġardjażi.Fl-2004, ġiet inkluża fl-Inizjattiva tal-Mard Traskurat tad-WHO minħabba l-prevalenza għolja tagħha fuq 6 snin, speċjalment f'komunitajiet ta' status soċjoekonomiku baxx [32].Is-sistema immuni innata għandha rwol kritiku fir-rispons immuni għall-infezzjoni G. duodenalis.Il-makrofagi tal-ġrieden ġew irrappurtati li jegħlbu u joqtlu G. duodenalis billi jirrilaxxaw nases extraċellulari [33].Studji preċedenti tagħna wrew li G. duodenalis, parassita extraċellulari mhux invażiv, jattiva mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni infjammatorja p38 MAPK, ERK, NF-κB p65, u NLRP3 fil-makrofaġi tal-ġrieden biex jirregolaw risponsi infjammatorji ospitanti, u GEV rilaxxat jista' jtejjeb dan il-proċess.13], 24].Madankollu, il-PAMPs eżatti involuti fl-infjammazzjoni regolata mill-infjammasomi NLRP3 f'GEV u r-rwol ta 'NLRP3 inflammasome fil-ġardjażi għad iridu jiġu eluċidati.Biex jitfa’ dawl fuq dawn iż-żewġ mistoqsijiet, għamilna dan l-istudju.
L-inflammasome NLRP3 jinsab fiċ-ċitoplasma taċ-ċelluli immuni u jista 'jiġi attivat minn diversi partiċelli bħal kristalli ta' aċidu uriku, tossini, batterji, viruses u parassiti.Fi studji batterjali, it-tossini ġew identifikati bħala PAMPs ewlenin li jattivaw sensuri infjammatorji, li jwasslu għal infjammazzjoni u mewt taċ-ċelluli [34].Xi tossini strutturalment differenti, bħal hemolysin minn Staphylococcus aureus [35] u Escherichia coli [36], hemolysin BL (HBL) minn enterotoxin (NHE) [37], jinduċu l-attivazzjoni tal-infjammazzjoni NLRP3.Studji virali wrew li proteini tal-virulenza bħall-proteina tal-envelop (E) tas-SARS-COV-2 [38] u l-proteina NS5 tal-virus Zika [39] huma PAMPs importanti rikonoxxuti mir-riċettur NLRP3.Fi studji dwar il-parassiti, ħafna parassiti ġew irrappurtati li huma assoċjati mal-attivazzjoni tal-infjammasomi ospitanti, bħal Toxoplasma gondii, Trichomonas vaginalis [40], Trypanosoma cruzi [41] u Leishmania [42].Il-proteini tal-granuli densi GRA35, GRA42, u GRA43, assoċjati mal-virulenza ta 'Toxoplasma gondii, huma meħtieġa għall-induzzjoni ta' piroptosi fil-makrofaġi tal-firien Lewis [43].Barra minn hekk, xi studji Leishmania ffukaw fuq molekuli individwali involuti fl-inflammasome NLRP3, bħal lipofosfoglikan tal-membrana tal-parassiti [44] jew metalloprotease taż-żingu [45].Fost il-familja ta' ġeni alpha-giardin li jixbħu lill-annexin, alpha-1 giardin intwera li huwa kandidat potenzjali għat-tilqim li jipprovdi protezzjoni kontra G. duodenalis f'mudell tal-ġurdien [18].Fl-istudju tagħna, għażilna fatturi ta 'virulenza ta' G. duodenalis alpha-2 u alpha-7,3 giardines, li huma uniċi għal giardia iżda relattivament inqas irrappurtati.Dawn iż-żewġ ġeni fil-mira ġew ikklonati fil-vettur tas-sistema tal-espressjoni ewkarjotika pcDNA3.1(+) għall-analiżi tal-attivazzjoni tal-infjammazzjoni.
Fil-mudell tal-ġurdien tagħna, frammenti ta 'caspase maqsuma jservu bħala markaturi ta' attivazzjoni infjammatorja.Mal-istimulazzjoni, NLRP3 jinteraġixxi ma 'ASC, jirrekluta procaspases, u jiġġenera caspases attivi li jaqsmu pro-IL-1β u pro-IL-18 f'IL-1β u IL-18 maturi, rispettivament -18.Caspases infjammatorji (caspases-1, -4, -5 u -11) huma familja kkonservata ta 'cysteine ​​​​proteases li huma kritiċi għad-difiża intrinsika u huma involuti fl-infjammazzjoni u l-mewt taċ-ċelluli programmata [46].Caspase-1 huwa attivat minn inflammasomes kanoniċi [47], filwaqt li caspases-4, -5, u -11 huma maqsuma waqt il-formazzjoni ta 'inflammasomes atipiċi [48].F'dan l-istudju, użajna makrofaġi peritoneali tal-ġrieden bħala mudell u investigajna p20 caspase-1 cleaved caspase-1 bħala markatur ta 'attivazzjoni ta' infjammazzjoni NLRP3 ospitanti fi studji ta 'infezzjoni G. duodenalis.Ir-riżultati wrew li ħafna alpha-giardins huma responsabbli għall-attivazzjoni tipika tal-infjammazzjoni, li hija konsistenti mal-iskoperta ta 'molekuli ta' virulenza ewlenin involuti fil-batterji u l-viruses.Madankollu, l-istudju tagħna huwa biss skrin preliminari u hemm molekuli oħra li jistgħu jattivaw inflammasomes mhux klassiċi, peress li l-istudju preċedenti tagħna sab kemm inflammasomes klassiċi kif ukoll mhux klassiċi fl-infezzjoni G. duodenalis [13].Biex niddeterminaw aktar jekk il-p20 caspase-1 iġġenerat hijiex assoċjata mal-inflammasome NLRP3, aħna ttrasfettajna alpha-2 u alpha-7.3 giardins f'makrofagi peritoneali tal-ġrieden biex niddeterminaw il-livelli ewlenin ta 'espressjoni tal-proteini tal-molekula u l-livelli ta' oligomerizzazzjoni ASC, u kkonfermaw li ż-żewġ α-giardins jattivaw inflammasome NLRP3.Ir-riżultati tagħna huma kemmxejn differenti minn dawk ta 'Manko-Prykhoda et al., li rrappurtaw li l-istimulazzjoni ta' ċelluli Caco-2 bi razez EPEC ta 'G. muris jew E. coli waħedhom jistgħu jżidu l-intensità tal-fluworexxenza ta' NLRP3, ASC, u caspase-1, għalkemm mhux b'mod sinifikanti, filwaqt li kif il-kostimulazzjoni ta 'G. muris u E. coli żiedet il-livelli ta' tliet proteini [49].Din id-diskrepanza tista 'tkun dovuta għal differenzi fl-għażla ta' speċi Giardia, linji ta 'ċelluli, u ċelloli primarji.Aħna wettaqna wkoll analiżi in vivo bl-użu ta 'MCC950 f'ġrieden femminili WT C57BL/6 ta' 5 ġimgħat, li huma aktar suxxettibbli għal G. duodenalis.MCC950 huwa inibitur qawwi u selettiv ta 'molekula żgħira NLRP3 li jimblokka l-attivazzjoni ta' NLRP3 kanonika u mhux kanonika f'konċentrazzjonijiet nanomolari.MCC950 jinibixxi l-attivazzjoni ta 'NLRP3 iżda ma jaffettwax l-attivazzjoni ta' mogħdijiet infjammatorji AIM2, NLRC4, u NLRP1 jew mogħdijiet ta 'sinjalazzjoni TLR [27].MCC950 jimblokka l-attivazzjoni ta 'NLRP3 iżda ma jinibixxix il-bidu ta' NLRP3, K+ efflux, Ca2+ influss, jew l-interazzjoni bejn NLRP3 u ASC;minflok, jinibixxi l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 billi jimblokka l-oligomerizzazzjoni ASC [27].Għalhekk, użajna MCC950 fi studju in vivo biex niddeterminaw ir-rwol tal-inflammasome NLRP3 wara injezzjoni ta 'giardine.Caspase-1 p10 attivat taqsam ċitokini pro-infjammatorji pro-IL-1β u pro-IL-18 f'IL-1β u IL-18 maturi [50].F'dan l-istudju, il-livelli ta 'IL-1β fis-serum fi ġrieden ittrattati bil-giardine bi jew mingħajr MCC950 intużaw bħala indikatur ta' jekk l-inflammasome NLRP3 kienx attivat.Kif mistenni, it-trattament MCC950 naqqas b'mod sinifikanti l-livelli ta 'IL-1β fis-serum.Din id-dejta turi biċ-ċar li G. duodenalis giardin alfa-2 u giardin alfa-7.3 huma kapaċi jattivaw l-inflammasome tal-ġurdien NLRP3.
Dejta sinifikanti akkumulata matul l-aħħar għaxar snin wriet li IL-17A huwa r-regolatur ewlieni tal-immunità kontra G. muris, li jinduċi sinjalazzjoni ta 'IL-17RA, jipproduċi peptidi antimikrobiċi, u jirregola l-attivazzjoni tal-kompliment [51].Madankollu, l-infezzjoni Giardia sseħħ aktar ta 'spiss f'adulti żgħażagħ, u ġie rrappurtat li l-infezzjoni Giardia fil-ġrieden żgħar ma jattivax ir-rispons IL-17A biex jeżerċita l-effett protettiv tiegħu [52], u wassal lir-riċerkaturi biex ifittxu Giardia immunomodulatorja oħra.mekkaniżmi ta 'infezzjoni helminth.L-awturi ta 'studju reċenti rrappurtaw li G. muris jista' jattiva l-inflammasome NLRP3 minn E. coli EPEC, li jippromwovi l-produzzjoni ta 'peptidi antimikrobiċi u jnaqqas il-kapaċità ta' twaħħil tiegħu u n-numru ta 'trofozoites fil-passaġġ intestinali, u b'hekk inaqqas is-severità tal-kolon. mard ikkawżat minn baċilli [49].L-inflammasome NLRP3 huwa involut fl-iżvilupp ta 'diversi mard.Studji wrew li Pseudomonas aeruginosa iqanqal awtofaġija fil-makrofaġi biex tiġi evitata l-mewt taċ-ċelluli, u dan il-proċess jiddependi fuq l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 [53].Għal N. caninum, l-attivazzjoni medjata mill-ispeċi tal-ossiġnu reattiv tal-inflammasome NLRP3 tillimita r-replikazzjoni tagħha fl-ospitant, u tagħmilha mira terapewtika potenzjali [9].Paracoccidioides brasiliensis instab li jinduċi l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 fiċ-ċelloli dendritiċi derivati ​​mill-mudullun tal-ġrieden, li jirriżulta fir-rilaxx taċ-ċitokin infjammatorju IL-1β, li għandu rwol kritiku fid-difiża tal-host [10].Diversi speċi ta 'Leishmania, inklużi L. amazonensis, L. major, L. braziliensis, u L. infantum chagasi, jattivaw NLRP3 u caspase-1 dipendenti fuq ASC fil-makrofaġi, kif ukoll infezzjoni Leishmania.Ir-replikazzjoni tal-parassiti hija msaħħa fil-ġrieden defiċjenti fil-ġene NLRP3/ASC/caspase-1 [11].Zamboni et al.Infezzjoni Leishmania ġiet irrappurtata li tinduċi attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 fil-makrofaġi, li tillimita r-replikazzjoni tal-parassiti intraċellulari.Għalhekk, Leishmania tista 'tinibixxi l-attivazzjoni ta' NLRP3 bħala strateġija ta 'evitar.Fi studji in vivo, l-inflammasome NLRP3 ikkontribwixxa għall-eliminazzjoni ta 'Leishmania, iżda ma affettwax it-tessuti [54].Bil-maqlub, fi studji tal-helminthiasis, l-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 trażżan l-immunità protettiva tal-host kontra l-elminthiasis gastrointestinali [12].Shigella hija waħda mill-batterji ewlenin li jikkawżaw id-dijarea madwar id-dinja.Dawn il-batterji jistgħu jinduċu produzzjoni ta 'IL-1β permezz ta' efflux K + medjat mir-riċettur P2X7, speċi reattivi ta 'ossiġnu, aċidifikazzjoni lisosomali, u ħsara mitokondrijali.L-inflammasome NLRP3 jirregola b'mod negattiv il-fagoċitosi u l-attività batteriċida tal-makrofaġi kontra Shigella [55].Studji ta' Plasmodium wrew li ġrieden defiċjenti ta' AIM2, NLRP3 jew caspase-1 infettati bil-Plasmodium jipproduċu livelli għoljin ta' interferon tat-tip 1 u huma aktar reżistenti għall-infezzjoni Plasmodium [56].Madankollu, ir-rwol ta 'alpha-2 giardine u alpha-7.3 giardine fl-induzzjoni ta' attivazzjoni patoġenika ta 'infjammazzjoni NLRP3 fil-ġrieden mhuwiex ċar.
F'dan l-istudju, l-inibizzjoni tal-inflammasome NLRP3 minn MCC950 naqqset il-BW u żiedet in-numru ta 'trofozoites fil-fluwidu tal-ħasil intestinali fil-ġrieden, li jirriżulta f'bidliet patoloġiċi aktar severi fit-tessut duwodenali.Alpha-2 giardine u alpha-7.3 giardine jattivaw il-ġurdien ospitanti NLRP3 inflammasome, iżidu l-piż tal-ġisem tal-ġurdien, inaqqsu n-numru ta 'trofozoites fil-fluwidu tal-ħasil intestinali, u jtaffu leżjonijiet duwodenali patoloġiċi.Dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li G. duodenalis jista 'jattiva l-inflammasome ospitanti NLRP3 permezz ta' alpha-2 giardine u alpha-7,3 giardine, u jnaqqas il-patoġeniċità ta 'G. duodenalis fil-ġrieden.
B'mod kollettiv, ir-riżultati tagħna juru li alpha-2 u alpha-7.3 giardines jinduċu l-attivazzjoni tal-inflammasome ospitanti NLRP3 u jnaqqsu l-infettività ta 'G. duodenalis fil-ġrieden.Għalhekk, dawn il-molekuli huma miri promettenti għall-prevenzjoni tal-ġardjażi.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
Liang AKS, Liang AAM, Huang AHC, Sergi KM, Kam JKM.Giardiasis: ħarsa ġenerali.Dan l-aħħar ġie żvelat li Pat Inflamm huwa allerġiku għad-drogi.2019;13:134–43.
Escobedo AA, Tsimerman S. Giardiasis: reviżjoni tal-farmakoterapija.Opinjoni esperta ta' spiżjar.2007;8: 1885–902.
Tian Huafeng, Chen Bin, Wen Jianfeng.Giardiasis, reżistenza għall-mediċini u l-iskoperta ta 'miri ġodda.Jinfetta l-miri tad-droga tad-Disturd.2010;10:295–302.
Wang Z, Zhang X, Xiao Yi, Zhang W, Wu X, Qin T, eċċ NLRP3 inflammasome u mard infjammatorju.Ossidu Med Cell Longev.2020;2020:4063562.
Chen GY, Núñez G. Ir-rwol tal-inflammasome fl-infjammazzjoni intestinali u l-kanċer.Gastroenteroloġija.2011;141:1986–99.
Pellegrini C, Antonioli L, Lopez-Castejon G, Blandizzi C, Fornai M. Attivazzjoni inflammasome NLRP3 kanonika u atipika f'salib it-toroq ta 'tolleranza immuni u infjammazzjoni tal-musrana.pre-immuni.2017;8:36.
Li L, Wang XC, Gong PT, Zhang N, Zhang X, Li S, et al.L-attivazzjoni tal-inflammasome NLRP3 medjata minn ROS hija involuta b'rispons għal infezzjoni ta 'N. caninum.Vettur tal-parassiti.2020;13:449.