Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Vetturi tal-ġeni għat-trattament tal-fibrożi ċistika pulmonari għandhom ikunu mmirati lejn il-passaġġi tan-nifs konduttivi, peress li t-trasduzzjoni tal-pulmun periferali m'għandha l-ebda effett terapewtiku.L-effiċjenza tat-transduction virali hija direttament relatata mal-ħin ta 'residenza tat-trasportatur.Madankollu, fluwidi ta 'kunsinna bħal trasportaturi tal-ġeni jinfirxu b'mod naturali fl-alveoli waqt l-inalazzjoni, u partiċelli terapewtiċi ta' kwalunkwe forma jitneħħew malajr permezz tat-trasport mukoċiljari.L-estensjoni tal-ħin ta 'residenza tat-trasportaturi tal-ġeni fil-passaġġ respiratorju hija importanti iżda diffiċli biex tinkiseb.Partiċelli manjetiċi konjugati mat-trasportatur li jistgħu jiġu diretti lejn il-wiċċ tal-passaġġ respiratorju jistgħu jtejbu l-mira reġjonali.Minħabba problemi bl-immaġini in vivo, l-imġieba ta 'partiċelli manjetiċi żgħar bħal dawn fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs fil-preżenza ta' kamp manjetiku applikat hija mifhuma ħażin.L-għan ta 'dan l-istudju kien li juża immaġini sinkrotroni biex jivviżwalizza in vivo il-moviment ta' serje ta 'partiċelli manjetiċi fit-trakea ta' firien anestetizzati sabiex jiġu studjati d-dinamika u l-mudelli ta 'mġieba ta' partiċelli singoli u bulk in vivo.Imbagħad ivvalutajna wkoll jekk il-kunsinna ta 'partiċelli manjetiċi lentivirali fil-preżenza ta' kamp manjetiku kienx iżżid l-effiċjenza tat-trasduzzjoni fit-trakea tal-firien.L-immaġini bir-raġġi X tas-Synchrotron turi l-imġieba ta 'partiċelli manjetiċi f'kampijiet manjetiċi stazzjonarji u li jiċċaqilqu in vitro u in vivo.Il-partiċelli ma jistgħux jiġu mkaxkra faċilment fuq il-wiċċ tal-passaġġi tal-arja ħajjin bl-użu ta 'kalamiti, iżda waqt it-trasport, id-depożiti huma kkonċentrati fil-kamp viżiv, fejn il-kamp manjetiku huwa l-aktar b'saħħtu.L-effiċjenza tat-trasduzzjoni żdiedet ukoll sitt darbiet meta partiċelli manjetiċi lentivirali ġew mogħtija fil-preżenza ta 'kamp manjetiku.Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-partiċelli manjetiċi lentivirali u l-kampijiet manjetiċi jistgħu jkunu approċċi siewja biex itejbu l-mira tal-vettur tal-ġeni u l-livelli ta 'transduzzjoni fil-passaġġi tan-nifs konduttivi in ​​vivo.
Il-fibrożi ċistika (CF) hija kkawżata minn varjazzjonijiet f'ġene wieħed imsejjaħ CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Il-proteina CFTR hija kanal joniku li huwa preżenti f'ħafna ċelluli epiteljali madwar il-ġisem, inklużi l-passaġġi tan-nifs, sit ewlieni fil-patoġenesi tal-fibrożi ċistika.Difetti fis-CFTR iwasslu għal trasport anormali tal-ilma, deidrazzjoni tal-wiċċ tal-passaġġ tal-arja, u tnaqqis fil-fond tas-saff tal-fluwidu tal-wiċċ tal-passaġġ tal-arja (ASL).Tfixkel ukoll il-kapaċità tas-sistema tat-trasport mukoċiljari (MCT) li tnaddaf il-passaġġi tan-nifs minn partiċelli u patoġeni li jinġibdu man-nifs.L-għan tagħna huwa li niżviluppaw terapija tal-ġeni lentivirali (LV) biex twassal il-kopja korretta tal-ġene CFTR u ttejjeb l-ASL, l-MCT u s-saħħa tal-pulmun, u nkomplu niżviluppaw teknoloġiji ġodda li jistgħu jkejlu dawn il-parametri in vivo1.
Vetturi LV huma wieħed mill-kandidati ewlenin għat-terapija tal-ġeni tal-fibrożi ċistika, prinċipalment minħabba li jistgħu jintegraw b'mod permanenti l-ġene terapewtiku fiċ-ċelloli bażali tal-passaġġ tal-arja (ċelloli staminali tal-passaġġ tal-arja).Dan huwa importanti għaliex jistgħu jirrestawraw l-idratazzjoni normali u t-tneħħija tal-mukus billi jiddifferenzjaw f'ċelluli funzjonali tal-wiċċ tal-passaġġ tal-arja kkoreġuti mill-ġeni assoċjati ma 'fibrożi ċistika, li jirriżultaw f'benefiċċji tul il-ħajja.Vetturi LV għandhom ikunu diretti kontra l-passaġġi tan-nifs konduttivi, peress li dan huwa fejn jibda l-involviment tal-pulmun fis-CF.It-twassil tal-vettur aktar fil-fond fil-pulmun jista 'jirriżulta fi trasduzzjoni alveolari, iżda dan m'għandu l-ebda effett terapewtiku fil-fibrożi ċistika.Madankollu, fluwidi bħal trasportaturi tal-ġeni jemigraw b'mod naturali fl-alveoli meta jittieħdu man-nifs wara t-twelid3,4 u partiċelli terapewtiċi jitkeċċew malajr fil-kavità orali mill-MCTs.L-effiċjenza tat-trasduzzjoni LV hija direttament relatata mat-tul ta 'żmien li l-vettur jibqa' qrib iċ-ċelloli fil-mira biex jippermetti l-assorbiment ċellulari - "ħin ta 'residenza" 5 li huwa faċilment imqassar minn fluss ta' arja reġjonali tipiku kif ukoll assorbiment koordinat ta 'mukus u partiċelli MCT.Għall-fibrożi ċistika, il-kapaċità li tittawwal il-ħin ta 'residenza LV fil-passaġġi tan-nifs hija importanti biex jinkisbu livelli għoljin ta' transduzzjoni f'dan il-qasam, iżda s'issa kienet ta 'sfida.
Biex negħlbu dan l-ostaklu, nipproponu li l-partiċelli manjetiċi LV (MPs) jistgħu jgħinu b'żewġ modi kumplimentari.L-ewwel, jistgħu jiġu ggwidati minn kalamita lejn il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs biex itejbu l-mira u jgħinu lill-partiċelli li jġorru l-ġeni jkunu fiż-żona t-tajba tal-passaġġ tan-nifs;u ASL) jimxu fis-saff taċ-ċelluli 6. Il-MPs jintużaw ħafna bħala mezzi mmirati għall-kunsinna tad-droga meta jingħaqdu ma’ antikorpi, mediċini tal-kimoterapija, jew molekuli żgħar oħra li jeħlu mal-membrani taċ-ċelluli jew jorbtu mar-riċetturi rispettivi tagħhom tal-wiċċ taċ-ċelluli u jakkumulaw fis-siti tat-tumur f’ preżenza ta 'elettriku statiku.Kampi manjetiċi għat-terapija tal-kanċer 7. Metodi "ipertermiċi" oħra huma mmirati biex joqtlu ċ-ċelloli tat-tumur billi jsaħħnu l-MPs meta jkunu esposti għal kampi manjetiċi li joxxillaw.Il-prinċipju tat-trasfezzjoni manjetika, li fih kamp manjetiku jintuża bħala aġent tat-trasfezzjoni biex itejjeb it-trasferiment tad-DNA fiċ-ċelloli, huwa komunement użat in vitro bl-użu ta 'firxa ta' vettori tal-ġeni mhux virali u virali għal linji taċ-ċelluli diffiċli biex jittrasduċu. ..Ġiet stabbilita l-effiċjenza tal-manjetotrasfezzjoni LV bil-kunsinna ta 'LV MP in vitro f'linja taċ-ċelluli ta' epitelju tal-bronki uman fil-preżenza ta 'kamp manjetiku statiku, u żiedet l-effiċjenza tat-trasduzzjoni b'186 darba meta mqabbla mal-vettur LV waħdu.LV MT ġie applikat ukoll għal mudell in vitro ta 'fibrożi ċistika, fejn it-trasfezzjoni manjetika żiedet it-transduction LV f'kulturi ta' interface arja-likwidu b'fattur ta '20 fil-preżenza ta' sputum ta 'fibrożi ċistika10.Madankollu, il-manjetotrasfezzjoni tal-organi in vivo rċeviet relattivament ftit attenzjoni u ġiet evalwata biss fi ftit studji fuq l-annimali11,12,13,14,15, speċjalment fil-pulmuni16,17.Madankollu, il-possibbiltajiet ta 'trasfezzjoni manjetika fit-terapija tal-pulmun fil-fibrożi ċistika huma ċari.Tan et al.(2020) iddikjara li “studju ta’ validazzjoni dwar kunsinna pulmonari effettiva ta’ nanopartiċelli manjetiċi se jwitti t-triq għal strateġiji futuri ta’ inalazzjoni CFTR biex itejbu r-riżultati kliniċi f’pazjenti b’fibrożi ċistika”6.
L-imġieba ta 'partiċelli manjetiċi żgħar fuq il-wiċċ tal-passaġġ respiratorju fil-preżenza ta' kamp manjetiku applikat hija diffiċli biex tiġi viżwalizzata u studjata, u għalhekk huma mifhuma ħażin.Fi studji oħra, żviluppajna metodu ta 'Immaġini X-Ray ta' Kuntrast tal-Fażi Ibbażat fuq Propagazzjoni Sinkrotron (PB-PCXI) għal immaġini mhux invażivi u kwantifikazzjoni ta 'bidliet minuti in vivo fil-fond ASL18 u l-imġieba MCT19,20 biex titkejjel direttament l-idratazzjoni tal-wiċċ tal-kanal tal-gass. u jintuża bħala indikatur bikri tal-effikaċja tat-trattament.Barra minn hekk, il-metodu ta 'punteġġ MCT tagħna juża partiċelli ta' dijametru ta '10-35 µm komposti minn alumina jew ħġieġ b'indiċi ta' rifrazzjoni għoli bħala markaturi MCT viżibbli b'PB-PCXI21.Iż-żewġ metodi huma adattati għall-immaġini ta 'firxa ta' tipi ta 'partiċelli, inklużi MPs.
Minħabba r-riżoluzzjoni spazjali u temporali għolja, l-assaġġi tagħna ASL u MCT bbażati fuq PB-PCXI huma adattati tajjeb biex jistudjaw id-dinamika u l-mudelli ta 'mġieba ta' partiċelli singoli u bl-ingrossa in vivo biex jgħinuna nifhmu u ottimizzaw il-metodi ta 'konsenja tal-ġene MP.L-approċċ li nużaw hawnhekk huwa bbażat fuq l-istudji tagħna bl-użu tal-linja tar-raġġ SPring-8 BL20B2, li fiha viżwalizzajna l-moviment tal-fluwidu wara l-kunsinna ta’ doża ta’ vettur finta fil-passaġġi tan-nifs tal-imnieħer u pulmonari tal-ġrieden biex ngħinu jispjegaw ix-xejriet eteroġenji tal-espressjoni tal-ġeni tagħna osservati. fil-ġene tagħna.studji fuq l-annimali b'doża ta' trasportatur ta' 3.4.
L-għan ta 'dan l-istudju kien li juża s-sinkrotron PB-PCXI biex jivviżwalizza movimenti in vivo ta' serje ta 'MPs fit-trakea ta' firien ħajjin.Dawn l-istudji tal-immaġini PB-PCXI kienu ddisinjati biex jittestjaw is-serje MP, is-saħħa tal-kamp manjetiku, u l-post biex jiddeterminaw l-effett tagħhom fuq il-moviment MP.Assumina li kamp manjetiku estern jgħin lill-MF ikkunsinnat jibqa 'jew jimxi lejn iż-żona fil-mira.Dawn l-istudji ppermettewlna wkoll niddeterminaw konfigurazzjonijiet ta 'kalamita li jimmassimizzaw l-ammont ta' partiċelli li jitħalla fit-trakea wara d-depożizzjoni.Fit-tieni serje ta’ studji, immirajna li nużaw din il-konfigurazzjoni ottimali biex nuru l-mudell ta’ transduzzjoni li jirriżulta mill-kunsinna in vivo ta’ LV-MPs lill-passaġġi tan-nifs tal-firien, fuq is-suppożizzjoni li tirriżulta l-kunsinna ta’ LV-MPs fil-kuntest tal-immirar tal-passaġġi tal-arja. f'żieda fl-effiċjenza tat-trasduzzjoni LV..
L-istudji kollha fuq l-annimali twettqu skont protokolli approvati mill-Università ta 'Adelaide (M-2019-060 u M-2020-022) u l-Kumitat tal-Etika tal-Annimali SPring-8 Synchrotron.L-esperimenti twettqu skont ir-rakkomandazzjonijiet ta’ ARRIVE.
L-immaġini tar-raġġi-x kollha ttieħdu fil-linja tar-raġġ BL20XU fis-sinkrotron SPring-8 fil-Ġappun bl-użu ta 'setup simili għal dak deskritt qabel21,22.Fil-qosor, il-kaxxa sperimentali kienet tinsab 245 m miċ-ċirku tal-ħażna tas-synchrotron.Distanza ta' kampjun għal rilevatur ta' 0.6 m tintuża għal studji ta' immaġini ta' partiċelli u 0.3 m għal studji ta' immaġini in vivo biex jinħolqu effetti ta' kuntrast tal-fażi.Intuża raġġ monokromatiku b'enerġija ta' 25 keV.L-immaġini ġew akkwistati bl-użu ta 'transducer tar-raġġi-X b'riżoluzzjoni għolja (SPring-8 BM3) akkoppjat ma' detector sCMOS.It-transducer jikkonverti r-raġġi-X f'dawl viżibbli billi juża xintillator ta' ħxuna ta' 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), li mbagħad jiġi dirett lejn is-sensor sCMOS billi juża objettiv mikroskopju ×10 (NA 0.3).Id-ditekter sCMOS kien Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, il-Ġappun) b'daqs ta 'firxa ta' 2048 × 2048 pixels u daqs ta 'pixel mhux maħdum ta' 6.5 × 6.5 µm.Dan l-issettjar jagħti daqs tal-pixel isotropiku effettiv ta' 0.51 µm u kamp viżiv ta' madwar 1.1 mm × 1.1 mm.It-tul ta 'espożizzjoni ta' 100 ms intgħażel biex jimmassimizza l-proporzjon tas-sinjal għall-istorbju ta 'partiċelli manjetiċi ġewwa u barra l-passaġġi tan-nifs filwaqt li jimminimizzaw l-artifacts tal-moviment ikkawżati min-nifs.Għal studji in vivo, tpoġġa shutter veloċi tar-raġġi-X fil-mogħdija tar-raġġi-X biex tillimita d-doża tar-radjazzjoni billi timblokka r-raġġ tar-raġġi-X bejn l-espożizzjonijiet.
Il-midja LV ma ntużatx fl-ebda studju tal-immaġini SPring-8 PB-PCXI minħabba li l-kamra tal-immaġini BL20XU mhijiex iċċertifikata Livell 2 ta' Bijosigurtà.Minflok, għażilna firxa ta’ MPs karatterizzati tajjeb minn żewġ bejjiegħa kummerċjali li jkopru firxa ta’ daqsijiet, materjali, konċentrazzjonijiet tal-ħadid, u applikazzjonijiet, — l-ewwel sabiex nifhmu kif il-kampi manjetiċi jaffettwaw il-moviment tal-MPs fil-kapillari tal-ħġieġ, u mbagħad f’ passaġġi tan-nifs ħajjin.wiċċ.Id-daqs tal-MP ivarja minn 0.25 sa 18 µm u huwa magħmul minn materjali varji (ara Tabella 1), iżda l-kompożizzjoni ta 'kull kampjun, inkluż id-daqs tal-partiċelli manjetiċi fl-MP, mhix magħrufa.Ibbażat fuq l-istudji MCT estensivi tagħna 19, 20, 21, 23, 24, nistennew li MPs sa 5 µm jistgħu jidhru fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs trakeali, pereżempju, billi jitnaqqsu frejms konsekuttivi biex tara viżibilità mtejba tal-moviment MP.MP wieħed ta '0.25 µm huwa iżgħar mir-riżoluzzjoni tal-apparat tal-immaġini, iżda PB-PCXI huwa mistenni li jiskopri l-kuntrast volumetriku tagħhom u l-moviment tal-likwidu tal-wiċċ li fuqu huma depożitati wara li jkunu depożitati.
Kampjuni għal kull MP fit-tabella.1 ġie ppreparat f'20 μl kapillari tal-ħġieġ (Drummond Microcaps, PA, USA) b'dijametru intern ta '0.63 mm.Partiċelli corpuskulari huma disponibbli fl-ilma, filwaqt li partiċelli CombiMag huma disponibbli fil-likwidu proprjetarju tal-manifattur.Kull tubu huwa nofsu mimli bil-likwidu (madwar 11 µl) u mqiegħed fuq il-kontenitur tal-kampjun (ara Figura 1).Il-kapillari tal-ħġieġ tqiegħdu orizzontalment fuq l-istadju fil-kamra tal-immaġini, rispettivament, u pożizzjonati fit-truf tal-likwidu.Kalamita b'qoxra tan-nikil ta' dijametru ta' 19 mm (tul ta' 28 mm) magħmula minn art rari, neodimju, ħadid u boron (NdFeB) (N35, cat. nru LM1652, Jaycar Electronics, Awstralja) b'remanenza ta' 1.17 T kienet imwaħħla ma' tabella ta 'trasferiment separata biex tikseb Ibdel mill-bogħod il-pożizzjoni tiegħek waqt l-għoti.L-immaġini tar-raġġi X jibda meta l-kalamita titqiegħed madwar 30 mm 'il fuq mill-kampjun u l-immaġini jiġu akkwistati b'4 frejms kull sekonda.Waqt l-immaġini, il-kalamita tressqet qrib it-tubu kapillari tal-ħġieġ (f'distanza ta 'madwar 1 mm) u mbagħad imċaqlaq tul it-tubu biex tevalwa l-effett tas-saħħa tal-kamp u l-pożizzjoni.
Setup ta' immaġini in vitro li jkun fih kampjuni MP f'kapillari tal-ħġieġ fl-istadju tat-traduzzjoni tal-kampjun xy.Il-mogħdija tar-raġġ tar-raġġi X hija mmarkata b'linja ħamra bit-tikek.
Ladarba ġiet stabbilita l-viżibilità in vitro tal-MPs, subsett minnhom ġie ttestjat in vivo fuq firien albini Wistar femminili tat-tip selvaġġ (~ 12-il ġimgħa, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Ġappun), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Ġappun) u butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Il-firien ġew anestetizzati b'taħlita Pharma (Ġappun) b'injezzjoni intraperitoneali.Wara l-anestesija, ġew ippreparati għall-immaġini billi jneħħu l-pil madwar it-trakea, daħħal tubu endotrakeali (ET; 16 Ga kannula ġol-vini, Terumo BCT), u immobilizzawhom fil-pożizzjoni supina fuq pjanċa tal-immaġini magħmula apposta li fiha borża termali. biex iżżomm it-temperatura tal-ġisem.22. Il-pjanċa tal-immaġini mbagħad twaħħlet mal-istadju tal-kampjun fil-kaxxa tal-immaġini f'angolu żgħir biex tallinja t-trakea orizzontalment fuq l-immaġni tar-raġġi-x kif muri fil-Figura 2a.
(a) Configurazzjoni tal-immaġini in vivo fl-unità tal-immaġini SPring-8, passaġġ tar-raġġ tar-raġġi X immarkat b'linja bit-tikek ħamra.(b, c) Il-lokalizzazzjoni tal-kalamita trakeali saret mill-bogħod bl-użu ta 'żewġ kameras IP immuntati ortogonalment.Fuq in-naħa tax-xellug tal-immaġni fuq l-iskrin, tista 'tara l-linja tal-wajer li żżomm ir-ras u l-kannula tal-kunsinna installata ġewwa t-tubu ET.
Sistema ta 'pompa tas-siringa kkontrollata mill-bogħod (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) bl-użu ta' siringa tal-ħġieġ ta '100 µl kienet imqabbda ma' tubu PE10 (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) bl-użu ta 'labra 30 Ga.Immarka t-tubu biex tiżgura li l-ponta tkun fil-pożizzjoni korretta fit-trakea meta ddaħħal it-tubu endotrakeali.Bl-użu ta 'mikropompa, il-planġer tas-siringa tneħħa u l-ponta tat-tubu ġiet mgħaddsa fil-kampjun MP li kellu jitwassal.It-tubu tal-kunsinna mgħobbi mbagħad ġie mdaħħal fit-tubu endotrakeali, u poġġiet il-ponta fl-iktar parti b'saħħitha tal-kamp manjetiku applikat mistenni tagħna.L-akkwist ta 'l-immaġini kien ikkontrollat ​​permezz ta' detector tan-nifs imqabbad mal-kaxxa tal-ħin tagħna bbażata fuq Arduino, u s-sinjali kollha (eż., temperatura, respirazzjoni, shutter miftuħ/għeluq, u akkwist ta 'immaġni) ġew irreġistrati bl-użu ta' Powerlab u LabChart (AD Instruments, Sydney, Awstralja) 22 Meta l-Immaġini Meta l-akkomodazzjoni ma kinitx disponibbli, żewġ kameras IP (Panasonic BB-SC382) ġew pożizzjonati f'madwar 90 ° lil xulxin u użati biex jikkontrollaw il-pożizzjoni tal-kalamita relattiva mat-trakea waqt l-immaġini (Figura 2b, c).Biex timminimizza l-artifacts tal-moviment, ġiet akkwistata immaġni waħda għal kull nifs matul il-plateau tal-fluss respiratorju terminali.
Il-kalamita hija mwaħħla mat-tieni stadju, li jista 'jinstab mill-bogħod fuq barra tal-ġisem tal-immaġini.Ġew ittestjati diversi pożizzjonijiet u konfigurazzjonijiet tal-kalamita, inklużi: imqiegħda f'angolu ta 'madwar 30 ° 'il fuq mit-trakea (il-konfigurazzjonijiet huma murija fil-Figuri 2a u 3a);kalamita waħda fuq l-annimal u l-oħra taħt, bl-arbli stabbiliti għall-attrazzjoni (Figura 3b)., kalamita waħda 'l fuq mill-annimal u waħda taħt, bil-poli stabbiliti għar-repulsjoni (Figura 3c), u kalamita waħda 'l fuq u perpendikolari għat-trakea (Figura 3d).Wara li twaqqaf l-annimal u l-kalamita u tgħabbi l-MP li qed jiġi ttestjat fil-pompa tas-siringa, agħti doża ta’ 50 µl b’rata ta’ 4 µl/sek mal-akkwist tal-immaġini.Il-kalamita mbagħad titmexxa 'l quddiem u lura tul jew tul it-trakea filwaqt li tkompli takkwista immaġini.
Konfigurazzjoni kalamita għall-immaġini in vivo (a) kalamita waħda 'l fuq mit-trakea f'angolu ta' madwar 30°, (b) żewġ kalamiti konfigurati għall-attrazzjoni, (c) żewġ kalamiti konfigurati għar-repulsjoni, (d) kalamita waħda 'l fuq u perpendikolari mal- trakea.L-osservatur ħares 'l isfel mill-ħalq għall-pulmuni permezz tat-trakea u r-raġġ tar-raġġi X għadda min-naħa tax-xellug tal-far u ħareġ min-naħa tal-lemin.Il-kalamita jew titmexxa tul it-tul tal-passaġġ tan-nifs jew ix-xellug u l-lemin 'il fuq mit-trakea fid-direzzjoni tar-raġġ tar-raġġi-X.
Fittixna wkoll li niddeterminaw il-viżibilità u l-imġiba tal-partiċelli fil-passaġġi tan-nifs fin-nuqqas ta 'taħlit ta' respirazzjoni u rata tal-qalb.Għalhekk, fl-aħħar tal-perjodu tal-immaġini, l-annimali ġew ewtanizzati b'mod uman minħabba doża eċċessiva ta 'pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg/kg ip).Xi annimali tħallew fuq il-pjattaforma tal-immaġini, u wara l-waqfien tan-nifs u t-taħbit tal-qalb, il-proċess tal-immaġini ġie ripetut, u żiedet doża addizzjonali ta 'MP jekk l-ebda MP ma kien viżibbli fuq il-wiċċ tal-passaġġ tal-arja.
L-immaġini li rriżultaw ġew ikkoreġuti għal kamp ċatt u skur u mbagħad assemblati f'film (20 frejm kull sekonda; 15–25 × veloċità normali skont ir-rata ta 'respirazzjoni) bl-użu ta' skript personalizzat miktub f'MATLAB (R2020a, The Mathworks).
L-istudji kollha dwar il-kunsinna tal-vettur tal-ġeni LV saru fiċ-Ċentru ta' Riċerka tal-Annimali tal-Laboratorju tal-Università ta' Adelaide u kellhom l-għan li jużaw ir-riżultati tal-esperiment SPring-8 biex jivvalutaw jekk il-kunsinna LV-MP fil-preżenza ta' kamp manjetiku tistax ittejjeb it-trasferiment tal-ġeni in vivo .Biex tevalwa l-effetti tal-MF u l-kamp manjetiku, ġew ittrattati żewġ gruppi ta 'annimali: grupp wieħed ġie injettat b'LV MF b'tqegħid ta' kalamita, u l-grupp l-ieħor ġie injettat bi grupp ta 'kontroll b'LV MF mingħajr kalamita.
Vetturi tal-ġeni LV ġew iġġenerati bl-użu ta 'metodi deskritti qabel 25, 26.Il-vettur LacZ jesprimi ġene beta-galactosidase lokalizzat nukleari mmexxi mill-promotur kostituttiv MPSV (LV-LacZ), li jipproduċi prodott ta 'reazzjoni blu f'ċelloli trasdotti, viżibbli fuq faċċati u sezzjonijiet tat-tessut tal-pulmun.It-titrazzjoni saret f'kulturi taċ-ċelluli billi ngħadd manwalment in-numru ta 'ċelluli pożittivi għal LacZ bl-użu ta' emoċitometru biex jiġi kkalkulat it-titru f'TU/ml.It-trasportaturi huma kjopreservati f'-80°C, imdewweb qabel l-użu, u marbutin ma' CombiMag billi jitħalltu 1:1 u jinkubaw fuq is-silġ għal mill-inqas 30 minuta qabel il-kunsinna.
Firien normali Sprague Dawley (n = 3/grupp, ~ 2-3 ip anestetizzati b'taħlita ta '0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Awstralja) u 60mg/kg ketamine (Ilium, Awstralja) f'xahar ta' età) ip ) injezzjoni u kannulazzjoni orali mhux kirurġika b'kannula ġol-vini ta' 16 Ga.Biex jiġi żgurat li t-tessut tal-passaġġ tan-nifs trakeali jirċievi transduzzjoni LV, ġie kkundizzjonat bl-użu tal-protokoll tagħna ta' perturbazzjoni mekkanika deskritta qabel li fih il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs trakeali kien jingħorok assjalment b'basket tal-wajer (N-Circle, estrattur tal-ġebel nitinol mingħajr ponta NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, l-Istati Uniti) 30 p28.Imbagħad, madwar 10 minuti wara t-tfixkil fil-kabinett tal-bijosigurtà, saret amministrazzjoni trakeali ta 'LV-MP.
Il-kamp manjetiku użat f'dan l-esperiment kien ikkonfigurat b'mod simili għal studju tar-raġġi-x in vivo, bl-istess kalamiti miżmuma fuq it-trakea b'klampi ta 'stent tad-distillazzjoni (Figura 4).Volum ta' 50 µl (2 x 25 µl alikwoti) ta' LV-MP ġie kkunsinnat fit-trakea (n = 3 annimali) bl-użu ta' pipetta bil-ponta tal-ġel kif deskritt qabel.Il-grupp ta 'kontroll (n = 3 annimali) irċieva l-istess LV-MP mingħajr l-użu ta' kalamita.Wara li titlesta l-infużjoni, il-kannula titneħħa mit-tubu endotrakeali u l-annimal jiġi esttubat.Il-kalamita tibqa' f'postha għal 10 minuti qabel ma titneħħa.Il-firien ġew dożati taħt il-ġilda b'meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Awstralja) segwit minn irtirar tal-anestesija b'injezzjoni intraperitoneali ta' 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Awstralja).Il-firien inżammu sħun u osservati sa l-irkupru sħiħ mill-anestesija.
Apparat ta 'kunsinna LV-MP f'kabinett tas-sigurtà bijoloġika.Tista 'tara li l-kmiem Luer-lock griż ċar tat-tubu ET joħroġ mill-ħalq, u l-ponta tal-pipetta tal-ġel murija fil-figura tiddaħħal mit-tubu ET sal-fond mixtieq fit-trakea.
Ġimgħa wara l-proċedura ta 'amministrazzjoni LV-MP, l-annimali ġew sagrifikati b'mod uman permezz ta' inalazzjoni ta '100% CO2 u l-espressjoni ta' LacZ ġiet evalwata bl-użu tat-trattament X-gal standard tagħna.It-tliet ċrieki tal-qarquċa l-aktar kawdali tneħħew biex jiġi żgurat li kwalunkwe ħsara mekkanika jew żamma ta 'fluwidu minħabba t-tqegħid ta' tubu endotrakeali ma tkunx inkluża fl-analiżi.Kull trakea kienet maqtugħa fit-tul biex tikseb żewġ nofsijiet għall-analiżi u mqiegħda f'tazza li kien fiha gomma tas-silikon (Sylgard, Dow Inc) bl-użu ta 'labra Minutien (Fine Science Tools) biex tara l-wiċċ luminali.Id-distribuzzjoni u l-karattru taċ-ċelloli trasdotti ġew ikkonfermati permezz ta 'fotografija frontali bl-użu ta' mikroskopju Nikon (SMZ1500) b'kamera DigiLite u softwer TCapture (Tucsen Photonics, iċ-Ċina).L-immaġini ġew akkwistati b'ingrandiment ta '20x (inkluż l-issettjar massimu għall-wisa' sħiħa tat-trakea), bit-tul kollu tat-trakea muri pass pass, li jipprovdi koinċidenza biżżejjed bejn kull immaġini biex tippermetti li l-immaġini jiġu "meħjutin".L-immaġini minn kull trakea mbagħad ġew magħquda f'immaġni komposta waħda bl-użu ta 'Composite Image Editor verżjoni 2.0.3 (Microsoft Research) bl-użu tal-algoritmu tal-moviment planari. Iż-żona ta 'espressjoni LacZ fi ħdan l-immaġini komposti trakeali minn kull annimal ġew ikkwantifikati bl-użu ta' skript MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel28, bl-użu ta 'settings ta' 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, u Value < 0.7. Iż-żona tal-espressjoni LacZ fi ħdan l-immaġini komposti trakeali minn kull annimal ġiet ikkwantifikata bl-użu ta’ script MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel28, bl-użu ta’ settings ta’ 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, u Value < 0.7. Площадь экспрессии lacz в составных изображениях трахеи от каждого животнот 'ыыла кла кола кыесестве nista' с и и тоатизированого сценария Matlab (R2020a, MathWorks), как к о aktar рано ране28, с и и и 0,35 <о т с и значение <0 ,7. Iż-żona ta' espressjoni ta' LacZ f'immaġini trakeali komposti minn kull annimal ġiet ikkwantifikata bl-użu ta' script MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel28 bl-użu ta' settings ta' 0.350.15 u valur<0 .7.如前所述，使用自动MATLAB 脚本（R2020a，MathWorks）对来自每只动物的气管复的尔管复合帟管复合帟复合帟复合帟述进行量化，使用0.35 < 色调< 0.58、饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置。如 前所 述 ， 自动 自动 Matlab 脚本 （（r2020a ， Mathworks） 来自 每 只 的 气管 的 的 管 复表达 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 HIP Области экспрессии lacz на составных изображениях трахеи каждого животнотногогогогоxxi количесено ппедеull ированного ценария Matlab (R2020a, MathWork е <0,7 . Żoni ta 'espressjoni ta' LacZ fuq stampi komposti tat-trakea ta 'kull annimal ġew ikkwantifikati bl-użu ta' script MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel bl-użu ta 'settings ta' 0.35 < lewn < 0.58, saturazzjoni > 0.15 u valur < 0.7 .Billi ssegwi l-kontorni tat-tessuti f'GIMP v2.10.24, inħolqot manwalment maskra għal kull immaġni komposta biex tidentifika ż-żona tat-tessut u tevita kwalunkwe skoperta falza barra t-tessut trakeali.Iż-żoni mtebbgħin mill-immaġini komposti kollha minn kull annimal ġew magħduda biex jagħtu l-erja mtebbgħin totali għal dak l-annimal.Iż-żona miżbugħa mbagħad ġiet diviża bl-erja totali tal-maskra biex tinkiseb żona normalizzata.
Kull trakea kienet inkorporata fil-paraffin u maqsuma 5 µm ħxuna.Is-sezzjonijiet ġew counterstained b'aħmar veloċi newtrali għal 5 minuti u l-immaġini ġew akkwistati bl-użu ta 'mikroskopju Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 u softwer għall-qbid tal-element NIS (verżjoni 5.20.00).
L-analiżi statistiċi kollha saru fi GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Is-sinifikat statistiku ġie stabbilit għal p ≤ 0.05.In-normalità ġiet ittestjata bl-użu tat-test Shapiro-Wilk u d-differenzi fit-tbajja 'LacZ ġew evalwati bl-użu ta' t-test mhux imqabbad.
Is-sitt MPs deskritti fit-Tabella 1 ġew eżaminati minn PCXI, u l-viżibilità hija deskritta fit-Tabella 2. Żewġ MPs tal-polistirene (MP1 u MP2; 18 µm u 0.25 µm, rispettivament) ma kinux viżibbli minn PCXI, iżda l-kampjuni li jifdal setgħu jiġu identifikati (eżempji huma murija fil-Figura 5).MP3 u MP4 huma dgħajjef viżibbli (10-15% Fe3O4; 0.25 µm u 0.9 µm, rispettivament).Għalkemm MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) kien fih xi wħud mill-iżgħar partiċelli ttestjati, kien l-aktar evidenti.Il-prodott CombiMag MP6 huwa diffiċli li ssir distinzjoni.Fil-każijiet kollha, il-kapaċità tagħna li niskopru MFs tjiebet ħafna billi ċċaqlaq il-kalamita 'l quddiem u lura paralleli mal-kapillari.Hekk kif il-kalamiti tbiegħdu mill-kapillari, il-partiċelli nġibdu 'l barra fi ktajjen twal, iżda hekk kif il-kalamiti resqu u s-saħħa tal-kamp manjetiku żdiedet, il-ktajjen tal-partiċelli tqassru hekk kif il-partiċelli emigraw lejn il-wiċċ ta' fuq tal-kapillari (ara Vidjo Supplimentari S1 : MP4), tiżdied id-densità tal-partiċelli fil-wiċċ.Bil-maqlub, meta l-kalamita titneħħa mill-kapillari, is-saħħa tal-kamp tonqos u l-MPs jirranġaw mill-ġdid fi ktajjen twal li jestendu mill-wiċċ ta 'fuq tal-kapillari (ara Vidjo Supplimentari S2: MP4).Wara li l-kalamita tieqaf tiċċaqlaq, il-partiċelli jkomplu jiċċaqilqu għal xi żmien wara li jilħqu l-pożizzjoni tal-ekwilibriju.Hekk kif l-MP jimxi lejn u 'l bogħod mill-wiċċ ta' fuq tal-kapillari, il-partiċelli manjetiċi għandhom it-tendenza li jiġbdu debris permezz tal-likwidu.
Il-viżibilità tal-MP taħt PCXI tvarja konsiderevolment bejn il-kampjuni.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 u (d) MP6.L-immaġini kollha murija hawn ittieħdu b'kalamita pożizzjonata bejn wieħed u ieħor 10 mm direttament 'il fuq mill-kapillari.Iċ-ċrieki kbar apparenti huma bżieżaq tal-arja maqbuda fil-kapillari, li juru b'mod ċar il-karatteristiċi tat-tarf iswed u abjad tal-immaġni tal-kuntrast tal-fażi.Il-kaxxa ħamra tindika l-ingrandiment li jsaħħaħ il-kuntrast.Innota li d-dijametri taċ-ċirkwiti tal-kalamita fil-figuri kollha mhumiex fuq skala u huma madwar 100 darba akbar minn dak muri.
Hekk kif il-kalamita timxi lejn ix-xellug u l-lemin tul in-naħa ta 'fuq tal-kapillari, l-angolu tas-sekwenza MP jinbidel biex jallinja mal-kalamita (ara Figura 6), u b'hekk tiddelinea l-linji tal-kamp manjetiku.Għal MP3-5, wara li l-korda tilħaq l-angolu tal-limitu, il-partiċelli jkaxkru tul il-wiċċ ta 'fuq tal-kapillari.Dan ħafna drabi jirriżulta f'MPs li jingħaqdu fi gruppi akbar qrib fejn il-kamp manjetiku huwa l-aktar b'saħħtu (ara Vidjo Supplimentari S3: MP5).Dan huwa wkoll speċjalment evidenti meta l-immaġini qrib it-tarf tal-kapillari, li jikkawża li l-MP jaggrega u jikkonċentra fl-interface tal-likwidu-arja.Il-partiċelli fl-MP6, li kienu aktar diffiċli biex jiddistingwu minn dawk fl-MP3-5, ma kaxkrux meta l-kalamita mxiet tul il-kapillari, iżda l-kordi MP dissoċjaw, u ħallew il-partiċelli fil-ħsieb (ara Vidjo Supplimentari S4: MP6).F'xi każijiet, meta l-kamp manjetiku applikat kien imnaqqas billi ċċaqlaq il-kalamita distanza twila mis-sit ta 'l-immaġini, kwalunkwe MPs li kien fadal niżel bil-mod sal-wiċċ tal-qiegħ tat-tubu bil-gravità, u baqa' fis-sekwenza (ara Vidjo Supplimentari S5: MP3) .
L-angolu tas-sekwenza MP jinbidel hekk kif il-kalamita timxi lejn il-lemin 'il fuq mill-kapillari.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 u (d) MP6.Il-kaxxa ħamra tindika l-ingrandiment li jsaħħaħ il-kuntrast.Jekk jogħġbok innota li l-vidjows addizzjonali huma għal skopijiet informattivi peress li jiżvelaw struttura ta 'partiċelli importanti u informazzjoni dinamika li ma tistax tiġi viżwalizzata f'dawn l-immaġini statiċi.
It-testijiet tagħna wrew li ċ-ċaqliq tal-kalamita 'l quddiem u lura bil-mod tul it-trakea tiffaċilita l-viżwalizzazzjoni tal-MF fil-kuntest ta' moviment kumpless in vivo.Ma sarux testijiet in vivo minħabba li ż-żibeġ tal-polistirene (MP1 u MP2) ma kinux viżibbli fil-kapillari.Kull wieħed mill-erba' MFs li jifdal ġie ttestjat in vivo bl-assi twil tal-kalamita pożizzjonata fuq it-trakea f'angolu ta 'madwar 30 ° mal-vertikali (ara Figuri 2b u 3a), peress li dan irriżulta f'ktajjen MF itwal u kien aktar effettiv. minn kalamita..konfigurazzjoni mitmuma.MP3, MP4 u MP6 ma nstabux fit-trakea ta 'ebda annimali ħajjin.Meta viżwalizzaw il-passaġġ respiratorju tal-firien wara li qatlu l-annimali b'mod uman, il-partiċelli baqgħu inviżibbli anki meta ġie miżjud volum addizzjonali bl-użu ta 'pompa tas-siringa.MP5 kellu l-ogħla kontenut ta 'ossidu tal-ħadid u kien l-unika partiċella viżibbli, għalhekk intuża biex jevalwa u jikkaratterizza l-imġieba MP in vivo.
It-tqegħid tal-kalamita fuq it-trakea waqt l-inserzjoni ta 'MF irriżulta f'ħafna, iżda mhux kollha, MFs jiġu kkonċentrati fil-kamp ta' vista.Id-dħul trakeali tal-partiċelli jiġi osservat l-aħjar f'annimali ewtanizzati b'mod uman.Figura 7 u Vidjo Supplimentari S6: MP5 juri qbid manjetiku rapidu u allinjament ta 'partiċelli fuq il-wiċċ tat-trakea ventrali, li jindika li MPs jistgħu jkunu mmirati lejn żoni mixtieqa tat-trakea.Meta tfittxija aktar distalment tul it-trakea wara l-kunsinna MF, xi MFs instabu eqreb lejn il-carina, li tindika qawwa tal-kamp manjetiku insuffiċjenti biex jiġbru u jżommu l-MFs kollha, peress li ġew mogħtija permezz tar-reġjun tal-qawwa massima tal-kamp manjetiku matul l-amministrazzjoni tal-fluwidu.proċess.Madankollu, il-konċentrazzjonijiet ta 'MP wara t-twelid kienu ogħla madwar iż-żona tal-immaġni, li jissuġġerixxu li ħafna MPs baqgħu f'reġjuni tal-passaġġi tal-arja fejn is-saħħa tal-kamp manjetiku applikat kienet l-ogħla.
Stampi ta' (a) qabel u (b) wara l-kunsinna ta' MP5 fit-trakea ta' far ewtanizzat reċentement b'kalamita mqiegħda eżatt fuq iż-żona tal-immaġini.Iż-żona murija tinsab bejn żewġ ċrieki kartilaġini.Hemm xi fluwidu fil-passaġġi tan-nifs qabel ma jingħata l-MP.Il-kaxxa ħamra tindika l-ingrandiment li jsaħħaħ il-kuntrast.Dawn l-immaġini huma meħuda mill-video dehru f'S6: Video Supplimentari MP5.
Iċ-ċaqliq tal-kalamita tul it-trakea in vivo rriżulta f'bidla fl-angolu tal-katina MP fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs, simili għal dak osservat fil-kapillari (ara Figura 8 u Vidjo Supplimentari S7: MP5).Madankollu, fl-istudju tagħna, MPs ma setgħux jiġu mkaxkra tul il-wiċċ tal-passaġġi respiratorji ħajjin, kif jistgħu jagħmlu l-kapillari.F'xi każijiet, il-katina MP tittawwal hekk kif il-kalamita timxi lejn ix-xellug u l-lemin.Interessanti, sibna wkoll li l-katina tal-partiċelli tbiddel il-fond tas-saff tal-wiċċ tal-fluwidu meta l-kalamita titmexxa b'mod lonġitudinali tul it-trakea, u tespandi meta l-kalamita titmexxa direttament 'l fuq u l-katina tal-partiċelli tiddawwar għal pożizzjoni vertikali (ara Vidjo Supplimentari S7).: MP5 f'0:09, qiegħ il-lemin).Il-mudell tal-moviment karatteristiku nbidel meta l-kalamita ġiet imċaqalqa lateralment fuq in-naħa ta 'fuq tat-trakea (jiġifieri, lejn ix-xellug jew il-lemin tal-annimal, aktar milli tul it-tul tat-trakea).Il-partiċelli kienu għadhom viżibbli b'mod ċar waqt il-moviment tagħhom, iżda meta l-kalamita tneħħiet mit-trakea, it-truf tal-kordi tal-partiċelli saru viżibbli (ara Vidjo Supplimentari S8: MP5, li jibda f'0:08).Dan jaqbel mal-imġieba osservata tal-kamp manjetiku taħt l-azzjoni ta 'kamp manjetiku applikat f'kapillari tal-ħġieġ.
Stampi ta’ kampjun li juru MP5 fit-trakea ta’ far anestetizzat ħaj.(a) Il-kalamita tintuża biex takkwista immaġini fuq u fuq ix-xellug tat-trakea, imbagħad (b) wara li tmexxi l-kalamita lejn il-lemin.Il-kaxxa ħamra tindika l-ingrandiment li jsaħħaħ il-kuntrast.Dawn l-immaġini huma mill-video li jidher fil-Vidjo Supplimentari ta' S7: MP5.
Meta ż-żewġ arbli ġew sintonizzati f'orjentazzjoni tat-trachea 'l fuq u taħt it-trakea (jiġifieri, jattiraw; Fig. 3b), il-kordi MP dehru itwal u kienu jinsabu fuq il-ħajt laterali tat-trakea aktar milli fuq il-wiċċ dorsali tal- trakea (ara l-Appendiċi).Vidjo S9:MP5).Madankollu, konċentrazzjonijiet għoljin ta 'partiċelli f'sit wieħed (jiġifieri, il-wiċċ dorsali tat-trakea) ma ġewx skoperti wara amministrazzjoni ta' fluwidu bl-użu ta 'apparat ta' kalamita doppja, li normalment iseħħ b'apparat ta 'kalamita waħda.Imbagħad, meta kalamita waħda ġiet ikkonfigurata biex tirrepeli l-arbli opposti (Figura 3c), in-numru ta 'partiċelli viżibbli fil-kamp viżiv ma żdiedx wara l-kunsinna.It-twaqqif taż-żewġ konfigurazzjonijiet ta 'kalamita huwa ta' sfida minħabba s-saħħa għolja tal-kamp manjetiku li tattira jew timbotta l-kalamiti rispettivament.Is-setup imbagħad inbidel għal kalamita waħda parallela mal-passaġġi tan-nifs iżda li tgħaddi mill-passaġġi tan-nifs f'angolu ta '90 grad sabiex il-linji tal-forza qasmu l-ħajt trakeali ortogonalment (Figura 3d), orjentazzjoni maħsuba biex tiddetermina l-possibbiltà ta' aggregazzjoni ta 'partikuli fuq il-ħajt laterali.jiġu osservati.Madankollu, f'din il-konfigurazzjoni, ma kien hemm l-ebda moviment ta 'akkumulazzjoni MF identifikabbli jew moviment tal-kalamita.Ibbażat fuq dawn ir-riżultati kollha, intgħażlet konfigurazzjoni b'kalamita waħda u orjentazzjoni ta '30 grad għal studji in vivo ta' trasportaturi tal-ġeni (Fig. 3a).
Meta l-annimal kien immaġinat bosta drabi immedjatament wara li ġie sagrifikat b'mod uman, in-nuqqas ta 'moviment tat-tessuti li jinterferixxi fisser li linji ta' partiċelli ifjen u iqsar setgħu jintgħarfu fil-qasam interkartilaġinuż ċar, 'jitbandal' skond il-moviment ta 'translazzjoni tal-kalamita.ara b'mod ċar il-preżenza u l-moviment tal-partiċelli MP6.
It-titru ta' LV-LacZ kien 1.8 x 108 IU/mL, u wara li tħallat 1:1 ma' CombiMag MP (MP6), l-annimali ġew injettati b'50 µl ta' doża trakeali ta' 9 x 107 IU/ml ta' vettura LV (jiġifieri 4.5 x 106 TU/far).).).F'dawn l-istudji, minflok ma nċaqalqu l-kalamita waqt ix-xogħol, iffissajna l-kalamita f'pożizzjoni waħda biex niddeterminaw jekk it-trasduzzjoni tal-LV setgħetx (a) tittejjeb meta mqabbel mal-kunsinna tal-vettur fin-nuqqas ta 'kamp manjetiku, u (b) jekk il-passaġġ tal-arja setgħetx. tkun iffukata.Iċ-ċelloli li qed jiġu trasdotti fiż-żoni fil-mira manjetiċi tal-passaġġ respiratorju ta 'fuq.
Il-preżenza ta 'kalamiti u l-użu ta' CombiMag flimkien ma 'vettori LV ma dehrux li jaffettwaw ħażin is-saħħa tal-annimali, kif għamel il-protokoll standard tagħna ta' kunsinna ta 'vettur LV.Immaġini ta 'quddiem tar-reġjun trakeali soġġetti għal perturbazzjoni mekkanika (Fig. 1 Supplimentari) urew li l-grupp trattat LV-MP kellu livelli ogħla b'mod sinifikanti ta' transduzzjoni fil-preżenza ta 'kalamita (Fig. 9a).Ammont żgħir biss ta 'tbajja' blu ta' LacZ kien preżenti fil-grupp ta 'kontroll (Figura 9b).Il-kwantifikazzjoni ta 'reġjuni normalizzati mtebbgħin X-Gal uriet li l-amministrazzjoni ta' LV-MP fil-preżenza ta 'kamp manjetiku rriżultat f'titjib ta' madwar 6 darbiet (Fig. 9c).
Eżempju ta 'immaġini komposti li juru transduzzjoni trakeali b'LV-MP (a) fil-preżenza ta' kamp manjetiku u (b) fin-nuqqas ta 'kalamita.(c) Titjib statistikament sinifikanti fiż-żona normalizzata tat-trasduzzjoni LacZ fit-trakea bl-użu ta 'kalamita (*p = 0.029, t-test, n = 3 għal kull grupp, medja ± żball standard tal-medja).
Sezzjonijiet newtrali mtebbgħin bl-aħmar veloċi (eżempju muri f'Fig. 2 Supplimentari) indikaw li ċ-ċelloli mtebbgħin b'LacZ kienu preżenti fl-istess kampjun u fl-istess post kif irrappurtat qabel.
L-isfida ewlenija fit-terapija tal-ġeni tal-passaġġi tal-arja tibqa 'l-lokalizzazzjoni preċiża tal-partiċelli tal-ġarr f'żoni ta' interess u l-kisba ta 'livell għoli ta' effiċjenza tat-trasduzzjoni fil-pulmun mobbli fil-preżenza ta 'fluss tal-arja u tneħħija attiva tal-mukus.Għal trasportaturi LV maħsuba għat-trattament ta 'mard respiratorju fil-fibrożi ċistika, iż-żieda tal-ħin ta' residenza tal-partiċelli ta 'ġarr fil-passaġġi tan-nifs konduttivi s'issa kienet għan li ma jintlaħaqx.Kif indikat minn Castellani et al., L-użu ta 'kampijiet manjetiċi biex itejbu t-trasduzzjoni għandu vantaġġi fuq metodi oħra ta' twassil tal-ġeni bħall-elettroporazzjoni minħabba li jista 'jgħaqqad is-sempliċità, l-ekonomija, il-kunsinna lokalizzata, iż-żieda fl-effiċjenza u l-ħin ta' inkubazzjoni iqsar.u possibbilment doża aktar baxxa ta' vettura10.Madankollu, id-depożizzjoni in vivo u l-imġieba ta 'partiċelli manjetiċi fil-passaġġi tan-nifs taħt l-influwenza ta' forzi manjetiċi esterni qatt ma ġew deskritti, u fil-fatt l-abbiltà ta 'dan il-metodu li jżid il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni fil-passaġġi tan-nifs ħajjin intatti ma ntwerietx in vivo.
L-esperimenti in vitro tagħna fuq is-sinkrotron PCXI urew li l-partiċelli kollha li ttestjajna, bl-eċċezzjoni tal-polistirene MP, kienu viżibbli fis-setup tal-immaġini li użajna.Fil-preżenza ta 'kamp manjetiku, kampi manjetiċi jiffurmaw kordi, li t-tul tagħhom huwa relatat mat-tip ta' partiċelli u s-saħħa tal-kamp manjetiku (jiġifieri, il-prossimità u l-moviment tal-kalamita).Kif muri fil-Figura 10, il-kordi li nosservaw huma ffurmati hekk kif kull partiċella individwali ssir manjetizzata u tinduċi l-kamp manjetiku lokali tagħha stess.Dawn l-oqsma separati jikkawżaw partiċelli simili oħra biex jiġbru u jgħaqqdu ma 'movimenti ta' spag tal-grupp minħabba forzi lokali mill-forzi lokali ta 'attrazzjoni u repulsjoni ta' partiċelli oħra.
Dijagramma li turi (a, b) ktajjen ta' partiċelli li jiffurmaw ġewwa kapillari mimlija fluwidu u (ċ, d) trakea mimlija bl-arja.Innota li l-kapillari u t-trakea mhumiex miġbuda fuq skala.Il-pannell (a) fih ukoll deskrizzjoni tal-MF li fih partiċelli Fe3O4 rranġati fi ktajjen.
Meta l-kalamita mċaqalqa fuq il-kapillari, l-angolu tas-sekwenza tal-partiċelli laħaq il-limitu kritiku għal MP3-5 li fih Fe3O4, wara li l-sekwenza tal-partiċelli m'għadhiex baqgħet fil-pożizzjoni oriġinali tagħha, iżda mxiet tul il-wiċċ għal pożizzjoni ġdida.kalamita.Dan l-effett x'aktarx iseħħ minħabba li l-wiċċ tal-kapillari tal-ħġieġ huwa lixx biżżejjed biex jippermetti li jseħħ dan il-moviment.Interessanti, MP6 (CombiMag) ma ġabx ruħu b'dan il-mod, forsi minħabba li l-partiċelli kienu iżgħar, kellhom kisi jew ħlas tal-wiċċ differenti, jew il-fluwidu tal-ġarr proprjetarju affettwa l-kapaċità tagħhom li jiċċaqilqu.Il-kuntrast fl-immaġni tal-partiċelli CombiMag huwa wkoll aktar dgħajjef, u jissuġġerixxi li l-likwidu u l-partiċelli jista 'jkollhom l-istess densità u għalhekk ma jistgħux jimxu faċilment lejn xulxin.Partiċelli jistgħu wkoll jeħlu jekk il-kalamita timxi malajr wisq, li jindika li s-saħħa tal-kamp manjetiku ma tistax dejjem tegħleb il-frizzjoni bejn il-partiċelli fil-fluwidu, li tissuġġerixxi li s-saħħa tal-kamp manjetiku u d-distanza bejn il-kalamita u ż-żona fil-mira m'għandhomx jiġu bħala a sorpriża.importanti.Dawn ir-riżultati jindikaw ukoll li għalkemm il-kalamiti jistgħu jaqbdu ħafna mikropartiċelli li jgħaddu miż-żona fil-mira, huwa improbabbli li l-kalamiti jistgħu jiġu bbażati fuqhom biex iċċaqilqu partiċelli CombiMag tul il-wiċċ tat-trakea.Għalhekk, aħna kkonkludejna li studji LV MF in vivo għandhom jużaw kampi manjetiċi statiċi biex jimmiraw fiżikament żoni speċifiċi tas-siġra tal-passaġġ tan-nifs.
Ladarba l-partiċelli jitwasslu fil-ġisem, huma diffiċli biex jiġu identifikati fil-kuntest tat-tessut kumpless li jiċċaqlaq tal-ġisem, iżda l-kapaċità ta 'skoperta tagħhom ġiet imtejba billi l-kalamita titmexxa orizzontalment fuq it-trakea biex "jiċċaqlaq" il-kordi MP.Filwaqt li l-immaġini f'ħin reali hija possibbli, huwa aktar faċli li wieħed jagħraf il-moviment tal-partiċelli wara li l-annimal ikun inqatel b'mod uman.Il-konċentrazzjonijiet tal-MP kienu ġeneralment l-ogħla f'dan il-post meta l-kalamita kienet pożizzjonata fuq iż-żona tal-immaġini, għalkemm xi partiċelli ġeneralment instabu aktar 'l isfel fit-trakea.B'differenza mill-istudji in vitro, il-partiċelli ma jistgħux jitkaxkru fit-trakea permezz tal-moviment ta 'kalamita.Din is-sejba hija konsistenti ma 'kif il-mukus li jkopri l-wiċċ tat-trakea tipikament jipproċessa partiċelli li jinġibdu man-nifs, jaqbadhom fil-mukus u sussegwentement ineħħihom permezz tal-mekkaniżmu ta' tneħħija muko-ċiljari.
Aħna ipoteżijna li l-użu ta 'kalamiti fuq u taħt it-trakea għall-attrazzjoni (Fig. 3b) jista' jirriżulta f'kamp manjetiku aktar uniformi, aktar milli kamp manjetiku li huwa kkonċentrat ħafna f'punt wieħed, li potenzjalment jirriżulta f'distribuzzjoni aktar uniformi ta 'partiċelli..Madankollu, l-istudju preliminari tagħna ma sabx evidenza ċara li tappoġġja din l-ipoteżi.Bl-istess mod, l-issettjar ta 'par ta' kalamiti biex jirribatti (Fig. 3c) ma rriżultax f'aktar partiċelli li jissetiljaw fiż-żona tal-immaġni.Dawn iż-żewġ sejbiet juru li s-setup b'kalamita doppja ma ttejjebx b'mod sinifikanti l-kontroll lokali tal-ippuntar MP, u li l-forzi manjetiċi qawwija li jirriżultaw huma diffiċli biex jiġu rranġati, u jagħmlu dan l-approċċ inqas prattiku.Bl-istess mod, l-orjentament tal-kalamita 'l fuq u tul it-trakea (Figura 3d) ukoll ma żiedx in-numru ta' partiċelli li fadal fiż-żona tal-immaġini.Xi wħud minn dawn il-konfigurazzjonijiet alternattivi jistgħu ma jirnexxux peress li jirriżultaw fi tnaqqis fil-qawwa tal-kamp manjetiku fiż-żona ta 'depożizzjoni.Għalhekk, il-konfigurazzjoni ta 'kalamita waħda fi 30 grad (Fig. 3a) hija meqjusa bħala l-aktar metodu ta' ttestjar in vivo sempliċi u effiċjenti.
L-istudju LV-MP wera li meta l-vettori LV ġew ikkombinati ma 'CombiMag u mogħtija wara li ġew disturbati fiżikament fil-preżenza ta' kamp manjetiku, il-livelli ta 'transduzzjoni żdiedu b'mod sinifikanti fit-trakea meta mqabbla mal-kontrolli.Ibbażat fuq studji ta 'l-immaġini ta' synchrotron u riżultati LacZ, il-kamp manjetiku deher li kien kapaċi jżomm l-LV fit-trakea u jnaqqas in-numru ta 'partiċelli tal-vettur li immedjatament ippenetraw fil-fond fil-pulmun.Tali titjib fil-mira jista’ jwassal għal effiċjenza ogħla filwaqt li jnaqqas it-titri mogħtija, it-trasduzzjoni mhux immirata, l-effetti sekondarji infjammatorji u immuni, u l-ispejjeż tat-trasferiment tal-ġeni.Importanti, skond il-manifattur, CombiMag jista 'jintuża flimkien ma' metodi oħra ta 'trasferiment tal-ġeni, inklużi vettori virali oħra (bħal AAV) u aċidi nuklejċi.