Grazzi talli żort Nature.com.Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għal CSS.Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew tiddiżattiva l-Modalità ta' Kompatibbiltà fl-Internet Explorer).Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, aħna se nirrendu s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Vetturi tal-ġeni għat-trattament tal-fibrożi ċistika pulmonari għandhom ikunu mmirati lejn il-passaġġi tan-nifs konduttivi, peress li t-trasduzzjoni tal-pulmun periferali m'għandha l-ebda effett terapewtiku.L-effiċjenza tat-transduction virali hija direttament relatata mal-ħin ta 'residenza tat-trasportatur.Madankollu, fluwidi ta 'kunsinna bħal trasportaturi tal-ġeni jinfirxu b'mod naturali fl-alveoli waqt l-inalazzjoni, u partiċelli terapewtiċi ta' kwalunkwe forma jitneħħew malajr permezz tat-trasport mukoċiljari.L-estensjoni tal-ħin ta 'residenza tat-trasportaturi tal-ġeni fil-passaġġ respiratorju hija importanti iżda diffiċli biex tinkiseb.Partiċelli manjetiċi konjugati mat-trasportatur li jistgħu jiġu diretti lejn il-wiċċ tal-passaġġ respiratorju jistgħu jtejbu l-mira reġjonali.Minħabba problemi bl-immaġini in vivo, l-imġieba ta 'partiċelli manjetiċi żgħar bħal dawn fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs fil-preżenza ta' kamp manjetiku applikat hija mifhuma ħażin.L-għan ta 'dan l-istudju kien li juża immaġini sinkrotroni biex jivviżwalizza in vivo il-moviment ta' serje ta 'partiċelli manjetiċi fit-trakea ta' firien anestetizzati sabiex jiġu studjati d-dinamika u l-mudelli ta 'mġieba ta' partiċelli singoli u bulk in vivo.Imbagħad ivvalutajna wkoll jekk il-kunsinna ta 'partiċelli manjetiċi lentivirali fil-preżenza ta' kamp manjetiku kienx iżżid l-effiċjenza tat-trasduzzjoni fit-trakea tal-firien.L-immaġini bir-raġġi X tas-Synchrotron turi l-imġieba ta 'partiċelli manjetiċi f'kampijiet manjetiċi stazzjonarji u li jiċċaqilqu in vitro u in vivo.Il-partiċelli ma jistgħux jiġu mkaxkra faċilment fuq il-wiċċ tal-passaġġi tal-arja ħajjin bl-użu ta 'kalamiti, iżda waqt it-trasport, id-depożiti huma kkonċentrati fil-kamp ta' vista, fejn il-kamp manjetiku huwa l-aktar b'saħħtu.L-effiċjenza tat-trasduzzjoni żdiedet ukoll sitt darbiet meta partiċelli manjetiċi lentivirali ġew mogħtija fil-preżenza ta 'kamp manjetiku.Meħuda flimkien, dawn ir-riżultati jissuġġerixxu li l-partiċelli manjetiċi lentivirali u l-kampijiet manjetiċi jistgħu jkunu approċċi siewja biex itejbu l-mira tal-vettur tal-ġeni u l-livelli ta 'transduzzjoni fil-passaġġi tan-nifs konduttivi in ​​vivo.
Il-fibrożi ċistika (CF) hija kkawżata minn varjazzjonijiet f'ġene wieħed imsejjaħ CF transmembrane conductance regulator (CFTR).Il-proteina CFTR hija kanal joniku li huwa preżenti f'ħafna ċelluli epiteljali madwar il-ġisem, inklużi l-passaġġi tan-nifs, sit ewlieni fil-patoġenesi tal-fibrożi ċistika.Difetti fis-CFTR iwasslu għal trasport anormali tal-ilma, deidrazzjoni tal-wiċċ tal-passaġġ tal-arja, u tnaqqis fil-fond tas-saff tal-fluwidu tal-wiċċ tal-passaġġ tal-arja (ASL).Tfixkel ukoll il-kapaċità tas-sistema tat-trasport mukoċiljari (MCT) li tnaddaf il-passaġġi tan-nifs minn partiċelli u patoġeni li jinġibdu man-nifs.L-għan tagħna huwa li niżviluppaw terapija tal-ġeni lentivirali (LV) biex twassal il-kopja korretta tal-ġene CFTR u ttejjeb l-ASL, l-MCT u s-saħħa tal-pulmun, u nkomplu niżviluppaw teknoloġiji ġodda li jistgħu jkejlu dawn il-parametri in vivo1.
Vetturi LV huma wieħed mill-kandidati ewlenin għat-terapija tal-ġeni tal-fibrożi ċistika, prinċipalment minħabba li jistgħu jintegraw b'mod permanenti l-ġene terapewtiku fiċ-ċelloli bażali tal-passaġġ tal-arja (ċelloli staminali tal-passaġġ tal-arja).Dan huwa importanti għaliex jistgħu jirrestawraw l-idratazzjoni normali u t-tneħħija tal-mukus billi jiddifferenzjaw f'ċelluli funzjonali tal-wiċċ tal-passaġġ tal-arja kkoreġuti mill-ġeni assoċjati ma 'fibrożi ċistika, li jirriżultaw f'benefiċċji tul il-ħajja.Vetturi LV għandhom ikunu diretti kontra l-passaġġi tan-nifs konduttivi, peress li dan huwa fejn jibda l-involviment tal-pulmun fis-CF.It-twassil tal-vettur aktar fil-fond fil-pulmun jista 'jirriżulta fi trasduzzjoni alveolari, iżda dan m'għandu l-ebda effett terapewtiku fil-fibrożi ċistika.Madankollu, fluwidi bħal trasportaturi tal-ġeni jemigraw b'mod naturali fl-alveoli meta jittieħdu man-nifs wara t-twelid3,4 u partiċelli terapewtiċi jitkeċċew malajr fil-kavità orali mill-MCTs.L-effiċjenza tat-trasduzzjoni LV hija direttament relatata mat-tul ta 'żmien li l-vettur jibqa' qrib iċ-ċelloli fil-mira biex jippermetti l-assorbiment ċellulari - "ħin ta 'residenza" 5 li huwa faċilment imqassar minn fluss ta' arja reġjonali tipiku kif ukoll assorbiment koordinat ta 'mukus u partiċelli MCT.Għall-fibrożi ċistika, il-kapaċità li tittawwal il-ħin ta 'residenza LV fil-passaġġi tan-nifs hija importanti biex jinkisbu livelli għoljin ta' transduzzjoni f'dan il-qasam, iżda s'issa kienet ta 'sfida.
Biex negħlbu dan l-ostaklu, nipproponu li l-partiċelli manjetiċi LV (MPs) jistgħu jgħinu b'żewġ modi kumplimentari.L-ewwel, jistgħu jiġu ggwidati minn kalamita lejn il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs biex itejbu l-mira u jgħinu lill-partiċelli li jġorru l-ġeni jkunu fiż-żona t-tajba tal-passaġġ tan-nifs;u ASL) jimxu fis-saff taċ-ċelluli 6. Il-MPs jintużaw ħafna bħala mezzi mmirati għall-kunsinna tad-droga meta jingħaqdu ma’ antikorpi, mediċini tal-kimoterapija, jew molekuli żgħar oħra li jeħlu mal-membrani taċ-ċelluli jew jorbtu mar-riċetturi rispettivi tagħhom tal-wiċċ taċ-ċelluli u jakkumulaw fis-siti tat-tumur f’ preżenza ta 'elettriku statiku.Kampi manjetiċi għat-terapija tal-kanċer 7. Metodi "ipertermiċi" oħra huma mmirati biex joqtlu ċ-ċelloli tat-tumur billi jsaħħnu l-MPs meta jkunu esposti għal kampi manjetiċi li joxxillaw.Il-prinċipju tat-trasfezzjoni manjetika, li fih kamp manjetiku jintuża bħala aġent tat-trasfezzjoni biex itejjeb it-trasferiment tad-DNA fiċ-ċelloli, huwa komunement użat in vitro bl-użu ta 'firxa ta' vettori tal-ġeni mhux virali u virali għal linji taċ-ċelluli diffiċli biex jittrasduċu. ..Ġiet stabbilita l-effiċjenza tal-manjetotrasfezzjoni LV bil-kunsinna ta 'LV MP in vitro f'linja taċ-ċelluli ta' epitelju tal-bronki uman fil-preżenza ta 'kamp manjetiku statiku, u żiedet l-effiċjenza tat-trasduzzjoni b'186 darba meta mqabbla mal-vettur LV waħdu.LV MT ġie applikat ukoll għal mudell in vitro ta 'fibrożi ċistika, fejn it-trasfezzjoni manjetika żiedet it-transduction LV f'kulturi ta' interface arja-likwidu b'fattur ta '20 fil-preżenza ta' sputum ta 'fibrożi ċistika10.Madankollu, il-manjetotrasfezzjoni tal-organi in vivo rċeviet relattivament ftit attenzjoni u ġiet evalwata biss fi ftit studji fuq l-annimali11,12,13,14,15, speċjalment fil-pulmuni16,17.Madankollu, il-possibbiltajiet ta 'trasfezzjoni manjetika fit-terapija tal-pulmun fil-fibrożi ċistika huma ċari.Tan et al.(2020) iddikjara li “studju ta’ validazzjoni dwar kunsinna pulmonari effettiva ta’ nanopartiċelli manjetiċi se jwitti t-triq għal strateġiji futuri ta’ inalazzjoni CFTR biex itejbu r-riżultati kliniċi f’pazjenti b’fibrożi ċistika”6.
L-imġieba ta 'partiċelli manjetiċi żgħar fuq il-wiċċ tal-passaġġ respiratorju fil-preżenza ta' kamp manjetiku applikat hija diffiċli biex tiġi viżwalizzata u studjata, u għalhekk huma mifhuma ħażin.Fi studji oħra, żviluppajna metodu ta 'Immaġini X-Ray ta' Kuntrast tal-Fażi Ibbażat fuq Propagazzjoni Sinkrotron (PB-PCXI) għal immaġini mhux invażivi u kwantifikazzjoni ta 'bidliet minuti in vivo fil-fond ASL18 u l-imġieba MCT19,20 biex titkejjel direttament l-idratazzjoni tal-wiċċ tal-kanal tal-gass. u jintuża bħala indikatur bikri tal-effikaċja tat-trattament.Barra minn hekk, il-metodu ta 'punteġġ MCT tagħna juża partiċelli ta' dijametru ta '10-35 µm komposti minn alumina jew ħġieġ b'indiċi ta' rifrazzjoni għoli bħala markaturi MCT viżibbli b'PB-PCXI21.Iż-żewġ metodi huma adattati għall-immaġini ta 'firxa ta' tipi ta 'partiċelli, inklużi MPs.
Minħabba r-riżoluzzjoni spazjali u temporali għolja, l-assaġġi tagħna ASL u MCT bbażati fuq PB-PCXI huma adattati tajjeb biex jistudjaw id-dinamika u l-mudelli ta 'mġieba ta' partiċelli singoli u bl-ingrossa in vivo biex jgħinuna nifhmu u ottimizzaw il-metodi ta 'konsenja tal-ġene MP.L-approċċ li nużaw hawnhekk huwa bbażat fuq l-istudji tagħna bl-użu tal-linja tar-raġġ SPring-8 BL20B2, li fiha viżwalizzajna l-moviment tal-fluwidu wara l-kunsinna ta’ doża ta’ vettur finta fil-passaġġi tan-nifs tal-imnieħer u pulmonari tal-ġrieden biex ngħinu jispjegaw ix-xejriet eteroġenji tal-espressjoni tal-ġeni tagħna osservati. fil-ġene tagħna.studji fuq l-annimali b'doża ta' trasportatur ta' 3.4.
L-għan ta 'dan l-istudju kien li juża s-sinkrotron PB-PCXI biex jivviżwalizza movimenti in vivo ta' serje ta 'MPs fit-trakea ta' firien ħajjin.Dawn l-istudji tal-immaġini PB-PCXI kienu ddisinjati biex jittestjaw is-serje MP, is-saħħa tal-kamp manjetiku, u l-post biex jiddeterminaw l-effett tagħhom fuq il-moviment MP.Assumina li kamp manjetiku estern jgħin lill-MF ikkunsinnat jibqa 'jew jimxi lejn iż-żona fil-mira.Dawn l-istudji ppermettewlna wkoll niddeterminaw konfigurazzjonijiet ta 'kalamita li jimmassimizzaw l-ammont ta' partiċelli li jitħalla fit-trakea wara d-depożizzjoni.Fit-tieni serje ta’ studji, immirajna li nużaw din il-konfigurazzjoni ottimali biex nuru l-mudell ta’ transduzzjoni li jirriżulta mill-kunsinna in vivo ta’ LV-MPs lill-passaġġi tan-nifs tal-firien, fuq is-suppożizzjoni li tirriżulta l-kunsinna ta’ LV-MPs fil-kuntest tal-immirar tal-passaġġi tal-arja. f'żieda fl-effiċjenza tat-trasduzzjoni LV..
L-istudji kollha fuq l-annimali twettqu skont protokolli approvati mill-Università ta 'Adelaide (M-2019-060 u M-2020-022) u l-Kumitat tal-Etika tal-Annimali SPring-8 Synchrotron.L-esperimenti twettqu skont ir-rakkomandazzjonijiet ta’ ARRIVE.
L-immaġini tar-raġġi-x kollha ttieħdu fil-linja tar-raġġ BL20XU fis-sinkrotron SPring-8 fil-Ġappun bl-użu ta 'setup simili għal dak deskritt qabel21,22.Fil-qosor, il-kaxxa sperimentali kienet tinsab 245 m miċ-ċirku tal-ħażna tas-synchrotron.Distanza ta' kampjun għal rilevatur ta' 0.6 m tintuża għal studji ta' immaġini ta' partiċelli u 0.3 m għal studji ta' immaġini in vivo biex jinħolqu effetti ta' kuntrast tal-fażi.Intuża raġġ monokromatiku b'enerġija ta' 25 keV.L-immaġini ġew akkwistati bl-użu ta 'transducer tar-raġġi-X b'riżoluzzjoni għolja (SPring-8 BM3) akkoppjat ma' detector sCMOS.It-transducer jikkonverti r-raġġi-X f'dawl viżibbli billi juża xintillator ta' ħxuna ta' 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), li mbagħad jiġi dirett lejn is-sensor sCMOS billi juża objettiv mikroskopju ×10 (NA 0.3).Id-ditekter sCMOS kien Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, il-Ġappun) b'daqs ta 'firxa ta' 2048 × 2048 pixels u daqs ta 'pixel mhux maħdum ta' 6.5 × 6.5 µm.Dan l-issettjar jagħti daqs tal-pixel iżotropiku effettiv ta' 0.51 µm u kamp viżiv ta' madwar 1.1 mm × 1.1 mm.It-tul ta 'espożizzjoni ta' 100 ms intgħażel biex jimmassimizza l-proporzjon tas-sinjal għall-istorbju ta 'partiċelli manjetiċi ġewwa u barra l-passaġġi tan-nifs filwaqt li jimminimizzaw l-artifacts tal-moviment ikkawżati min-nifs.Għal studji in vivo, tpoġġa shutter veloċi tar-raġġi-X fil-mogħdija tar-raġġi-X biex tillimita d-doża tar-radjazzjoni billi timblokka r-raġġ tar-raġġi-X bejn l-espożizzjonijiet.
Il-midja LV ma ntużatx fl-ebda studju tal-immaġini SPring-8 PB-PCXI minħabba li l-kamra tal-immaġini BL20XU mhijiex iċċertifikata Livell 2 ta' Bijosigurtà.Minflok, għażilna firxa ta’ MPs karatterizzati tajjeb minn żewġ bejjiegħa kummerċjali li jkopru firxa ta’ daqsijiet, materjali, konċentrazzjonijiet tal-ħadid, u applikazzjonijiet, — l-ewwel sabiex nifhmu kif il-kampi manjetiċi jaffettwaw il-moviment tal-MPs fil-kapillari tal-ħġieġ, u mbagħad f’ passaġġi tan-nifs ħajjin.wiċċ.Id-daqs tal-MP ivarja minn 0.25 sa 18 µm u huwa magħmul minn materjali varji (ara Tabella 1), iżda l-kompożizzjoni ta 'kull kampjun, inkluż id-daqs tal-partiċelli manjetiċi fl-MP, mhix magħrufa.Ibbażat fuq l-istudji MCT estensivi tagħna 19, 20, 21, 23, 24, nistennew li MPs sa 5 µm jistgħu jidhru fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs trakeali, pereżempju, billi jitnaqqsu frejms konsekuttivi biex tara viżibilità mtejba tal-moviment MP.MP wieħed ta '0.25 µm huwa iżgħar mir-riżoluzzjoni tal-apparat tal-immaġini, iżda PB-PCXI huwa mistenni li jiskopri l-kuntrast volumetriku tagħhom u l-moviment tal-likwidu tal-wiċċ li fuqu huma depożitati wara li jkunu depożitati.
Kampjuni għal kull MP fit-tabella.1 ġie ppreparat f'20 μl kapillari tal-ħġieġ (Drummond Microcaps, PA, USA) b'dijametru intern ta '0.63 mm.Partiċelli corpuskulari huma disponibbli fl-ilma, filwaqt li partiċelli CombiMag huma disponibbli fil-likwidu proprjetarju tal-manifattur.Kull tubu huwa nofsu mimli bil-likwidu (madwar 11 µl) u mqiegħed fuq il-kontenitur tal-kampjun (ara Figura 1).Il-kapillari tal-ħġieġ tqiegħdu orizzontalment fuq l-istadju fil-kamra tal-immaġini, rispettivament, u pożizzjonati fit-truf tal-likwidu.Kalamita b'qoxra tan-nikil ta' dijametru ta' 19 mm (tul ta' 28 mm) magħmula minn art rari, neodimju, ħadid u boron (NdFeB) (N35, cat. nru LM1652, Jaycar Electronics, Awstralja) b'remanenza ta' 1.17 T kienet imwaħħla ma' tabella ta 'trasferiment separata biex tikseb Ibdel mill-bogħod il-pożizzjoni tiegħek waqt l-għoti.L-immaġini tar-raġġi X jibda meta l-kalamita titqiegħed madwar 30 mm 'il fuq mill-kampjun u l-immaġini jiġu akkwistati b'4 frejms kull sekonda.Waqt l-immaġini, il-kalamita tressqet qrib it-tubu kapillari tal-ħġieġ (f'distanza ta 'madwar 1 mm) u mbagħad imċaqlaq tul it-tubu biex tevalwa l-effett tas-saħħa tal-kamp u l-pożizzjoni.
Setup ta' immaġini in vitro li jkun fih kampjuni MP f'kapillari tal-ħġieġ fl-istadju tat-traduzzjoni tal-kampjun xy.Il-mogħdija tar-raġġ tar-raġġi X hija mmarkata b'linja ħamra bit-tikek.
Ladarba ġiet stabbilita l-viżibilità in vitro tal-MPs, subsett minnhom ġie ttestjat in vivo fuq firien albini Wistar femminili tat-tip selvaġġ (~ 12-il ġimgħa, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Ġappun), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Ġappun) u butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Il-firien ġew anestetizzati b'taħlita Pharma (Ġappun) b'injezzjoni intraperitoneali.Wara l-anestesija, ġew ippreparati għall-immaġini billi jneħħu l-pil madwar it-trakea, daħħal tubu endotrakeali (ET; 16 Ga kannula ġol-vini, Terumo BCT), u immobilizzawhom fil-pożizzjoni supina fuq pjanċa tal-immaġini magħmula apposta li fiha borża termali. biex iżżomm it-temperatura tal-ġisem.22. Il-pjanċa tal-immaġini mbagħad twaħħlet mal-istadju tal-kampjun fil-kaxxa tal-immaġini f'angolu żgħir biex tallinja t-trakea orizzontalment fuq l-immaġni tar-raġġi-x kif muri fil-Figura 2a.
(a) Configurazzjoni tal-immaġini in vivo fl-unità tal-immaġini SPring-8, passaġġ tar-raġġ tar-raġġi X immarkat b'linja bit-tikek ħamra.(b, c) Il-lokalizzazzjoni tal-kalamita trakeali saret mill-bogħod bl-użu ta 'żewġ kameras IP immuntati ortogonalment.Fuq in-naħa tax-xellug tal-immaġni fuq l-iskrin, tista 'tara l-linja tal-wajer li żżomm ir-ras u l-kannula tal-kunsinna installata ġewwa t-tubu ET.
Sistema ta 'pompa tas-siringa kkontrollata mill-bogħod (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) bl-użu ta' siringa tal-ħġieġ ta '100 µl kienet imqabbda ma' tubu PE10 (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) bl-użu ta 'labra 30 Ga.Immarka t-tubu biex tiżgura li l-ponta tkun fil-pożizzjoni korretta fit-trakea meta ddaħħal it-tubu endotrakeali.Bl-użu ta 'mikropompa, il-planġer tas-siringa tneħħa u l-ponta tat-tubu ġiet mgħaddsa fil-kampjun MP li kellu jitwassal.It-tubu tal-kunsinna mgħobbi mbagħad ġie mdaħħal fit-tubu endotrakeali, u poġġiet il-ponta fl-iktar parti b'saħħitha tal-kamp manjetiku applikat mistenni tagħna.L-akkwist ta 'l-immaġini kien ikkontrollat ​​permezz ta' detector tan-nifs imqabbad mal-kaxxa tal-ħin tagħna bbażata fuq Arduino, u s-sinjali kollha (eż., temperatura, respirazzjoni, shutter miftuħ/għeluq, u akkwist ta 'immaġni) ġew irreġistrati bl-użu ta' Powerlab u LabChart (AD Instruments, Sydney, Awstralja) 22 Meta l-Immaġini Meta l-akkomodazzjoni ma kinitx disponibbli, żewġ kameras IP (Panasonic BB-SC382) ġew pożizzjonati f'madwar 90 ° lil xulxin u użati biex jikkontrollaw il-pożizzjoni tal-kalamita relattiva mat-trakea waqt l-immaġini (Figura 2b, c).Biex timminimizza l-artifacts tal-moviment, ġiet akkwistata immaġni waħda għal kull nifs matul il-plateau tal-fluss respiratorju terminali.
Il-kalamita hija mwaħħla mat-tieni stadju, li jista 'jinstab mill-bogħod fuq barra tal-ġisem tal-immaġini.Ġew ittestjati diversi pożizzjonijiet u konfigurazzjonijiet tal-kalamita, inklużi: imqiegħda f'angolu ta 'madwar 30 ° 'il fuq mit-trakea (il-konfigurazzjonijiet huma murija fil-Figuri 2a u 3a);kalamita waħda fuq l-annimal u l-oħra taħt, bl-arbli stabbiliti għall-attrazzjoni (Figura 3b)., kalamita waħda 'l fuq mill-annimal u waħda taħt, bil-poli stabbiliti għar-repulsjoni (Figura 3c), u kalamita waħda 'l fuq u perpendikolari għat-trakea (Figura 3d).Wara li twaqqaf l-annimal u l-kalamita u tgħabbi l-MP li qed jiġi ttestjat fil-pompa tas-siringa, agħti doża ta’ 50 µl b’rata ta’ 4 µl/sek mal-akkwist tal-immaġini.Il-kalamita mbagħad titmexxa 'l quddiem u lura tul jew tul it-trakea filwaqt li tkompli takkwista immaġini.
Konfigurazzjoni kalamita għall-immaġini in vivo (a) kalamita waħda 'l fuq mit-trakea f'angolu ta' madwar 30°, (b) żewġ kalamiti konfigurati għall-attrazzjoni, (c) żewġ kalamiti konfigurati għar-repulsjoni, (d) kalamita waħda 'l fuq u perpendikolari mal- trakea.L-osservatur ħares 'l isfel mill-ħalq għall-pulmuni permezz tat-trakea u r-raġġ tar-raġġi X għadda min-naħa tax-xellug tal-far u ħareġ min-naħa tal-lemin.Il-kalamita jew titmexxa tul it-tul tal-passaġġ tan-nifs jew ix-xellug u l-lemin 'il fuq mit-trakea fid-direzzjoni tar-raġġ tar-raġġi-X.
Fittixna wkoll li niddeterminaw il-viżibilità u l-imġiba tal-partiċelli fil-passaġġi tan-nifs fin-nuqqas ta 'taħlit ta' respirazzjoni u rata tal-qalb.Għalhekk, fl-aħħar tal-perjodu tal-immaġini, l-annimali ġew ewtanizzati b'mod uman minħabba doża eċċessiva ta 'pentobarbital (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~ 65 mg/kg ip).Xi annimali tħallew fuq il-pjattaforma tal-immaġini, u wara l-waqfien tan-nifs u t-taħbit tal-qalb, il-proċess tal-immaġini ġie ripetut, u żiedet doża addizzjonali ta 'MP jekk l-ebda MP ma kien viżibbli fuq il-wiċċ tal-passaġġ tal-arja.
L-immaġini li rriżultaw ġew ikkoreġuti għal kamp ċatt u skur u mbagħad assemblati f'film (20 frejm kull sekonda; 15–25 × veloċità normali skont ir-rata ta 'respirazzjoni) bl-użu ta' skript personalizzat miktub f'MATLAB (R2020a, The Mathworks).
L-istudji kollha dwar il-kunsinna tal-vettur tal-ġeni LV saru fiċ-Ċentru ta' Riċerka tal-Annimali tal-Laboratorju tal-Università ta' Adelaide u kellhom l-għan li jużaw ir-riżultati tal-esperiment SPring-8 biex jivvalutaw jekk il-kunsinna LV-MP fil-preżenza ta' kamp manjetiku tistax ittejjeb it-trasferiment tal-ġeni in vivo .Biex tevalwa l-effetti tal-MF u l-kamp manjetiku, ġew ittrattati żewġ gruppi ta 'annimali: grupp wieħed ġie injettat b'LV MF b'tqegħid ta' kalamita, u l-grupp l-ieħor ġie injettat bi grupp ta 'kontroll b'LV MF mingħajr kalamita.
Vetturi tal-ġeni LV ġew iġġenerati bl-użu ta 'metodi deskritti qabel 25, 26.Il-vettur LacZ jesprimi ġene beta-galactosidase lokalizzat nukleari mmexxi mill-promotur kostituttiv MPSV (LV-LacZ), li jipproduċi prodott ta 'reazzjoni blu f'ċelloli trasdotti, viżibbli fuq faċċati u sezzjonijiet tat-tessut tal-pulmun.It-titrazzjoni saret f'kulturi taċ-ċelluli billi ngħadd manwalment in-numru ta 'ċelluli pożittivi għal LacZ bl-użu ta' emoċitometru biex jiġi kkalkulat it-titru f'TU/ml.It-trasportaturi huma kjopreservati f'-80°C, imdewweb qabel l-użu, u marbutin ma' CombiMag billi jitħalltu 1:1 u jinkubaw fuq is-silġ għal mill-inqas 30 minuta qabel il-kunsinna.
Firien normali Sprague Dawley (n = 3/grupp, ~ 2-3 ip anestetizzati b'taħlita ta '0.4mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Awstralja) u 60mg/kg ketamine (Ilium, Awstralja) f'xahar ta' età) ip ) injezzjoni u kannulazzjoni orali mhux kirurġika b'kannula ġol-vini ta' 16 Ga.Biex jiġi żgurat li t-tessut tal-passaġġ tan-nifs trakeali jirċievi transduzzjoni LV, ġie kkundizzjonat bl-użu tal-protokoll tagħna ta' perturbazzjoni mekkanika deskritta qabel li fih il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs trakeali kien jingħorok assjalment b'basket tal-wajer (N-Circle, estrattur tal-ġebel nitinol mingħajr ponta NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, l-Istati Uniti) 30 p28.Imbagħad, madwar 10 minuti wara t-tfixkil fil-kabinett tal-bijosigurtà, saret amministrazzjoni trakeali ta 'LV-MP.
Il-kamp manjetiku użat f'dan l-esperiment kien ikkonfigurat b'mod simili għal studju tar-raġġi-x in vivo, bl-istess kalamiti miżmuma fuq it-trakea b'klampi ta 'stent tad-distillazzjoni (Figura 4).Volum ta' 50 µl (2 x 25 µl alikwoti) ta' LV-MP ġie kkunsinnat fit-trakea (n = 3 annimali) bl-użu ta' pipetta bil-ponta tal-ġel kif deskritt qabel.Il-grupp ta 'kontroll (n = 3 annimali) irċieva l-istess LV-MP mingħajr l-użu ta' kalamita.Wara li titlesta l-infużjoni, il-kannula titneħħa mit-tubu endotrakeali u l-annimal jiġi esttubat.Il-kalamita tibqa' f'postha għal 10 minuti qabel ma titneħħa.Il-firien ġew dożati taħt il-ġilda b'meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Awstralja) segwit minn irtirar tal-anestesija b'injezzjoni intraperitoneali ta' 1 mg/kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Awstralja).Il-firien inżammu sħun u osservati sa l-irkupru sħiħ mill-anestesija.
Apparat ta 'kunsinna LV-MP f'kabinett tas-sigurtà bijoloġika.Tista 'tara li l-kmiem Luer-lock griż ċar tat-tubu ET joħroġ mill-ħalq, u l-ponta tal-pipetta tal-ġel murija fil-figura tiddaħħal mit-tubu ET sal-fond mixtieq fit-trakea.
Ġimgħa wara l-proċedura ta 'amministrazzjoni LV-MP, l-annimali ġew sagrifikati b'mod uman permezz ta' inalazzjoni ta '100% CO2 u l-espressjoni ta' LacZ ġiet evalwata bl-użu tat-trattament X-gal standard tagħna.It-tliet ċrieki tal-qarquċa l-aktar kawdali tneħħew biex jiġi żgurat li kwalunkwe ħsara mekkanika jew żamma ta 'fluwidu minħabba t-tqegħid ta' tubu endotrakeali ma tkunx inkluża fl-analiżi.Kull trakea kienet maqtugħa fit-tul biex tikseb żewġ nofsijiet għall-analiżi u mqiegħda f'tazza li kien fiha gomma tas-silikon (Sylgard, Dow Inc) bl-użu ta 'labra Minutien (Fine Science Tools) biex tara l-wiċċ luminali.Id-distribuzzjoni u l-karattru taċ-ċelloli trasdotti ġew ikkonfermati permezz ta 'fotografija frontali bl-użu ta' mikroskopju Nikon (SMZ1500) b'kamera DigiLite u softwer TCapture (Tucsen Photonics, iċ-Ċina).L-immaġini ġew akkwistati b'ingrandiment ta '20x (inkluż l-issettjar massimu għall-wisa' sħiħa tat-trakea), bit-tul kollu tat-trakea muri pass pass, li jipprovdi koinċidenza biżżejjed bejn kull immaġini biex tippermetti li l-immaġini jiġu "meħjutin".L-immaġini minn kull trakea mbagħad ġew magħquda f'immaġni komposta waħda bl-użu ta 'Composite Image Editor verżjoni 2.0.3 (Microsoft Research) bl-użu tal-algoritmu tal-moviment planari. Iż-żona ta 'espressjoni LacZ fi ħdan l-immaġini komposti trakeali minn kull annimal ġew ikkwantifikati bl-użu ta' script MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel28, bl-użu ta 'settings ta' 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, u Value < 0.7. Iż-żona tal-espressjoni LacZ fi ħdan l-immaġini komposti trakeali minn kull annimal ġiet ikkwantifikata bl-użu ta’ script MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel28, bl-użu ta’ settings ta’ 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, u Value < 0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7. Iż-żona ta’ espressjoni ta’ LacZ f’immaġini trakeali komposti minn kull annimal ġiet ikkwantifikata bl-użu ta’ skript MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel28 bl-użu ta’ settings ta’ 0.350.15 u valur<0 .7.如 前所 述 ， 使用 自动 自动 MATLAB 脚本 （R2020A ， MathWorks） 对 来自 每 只 只 动物 的 气管 复合 图像 中 的 lacz 表达 区域 区域 进行 量化 ， 使用 0.35 <色调 <0.58 、 饱和度> 0.15 和值 <0.7 的 设置如 前所 述 ， 自动 自动 自动 MATLAB 脚本 （（R2020A ， MathWorks） 来自 每 只 的 的 气管 复合 图像 的 的 的 的 的 表达 表达 量化 量化 ， 使用 使用 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和值 <0.7 的 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 HIP Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Żoni ta 'espressjoni ta' LacZ fuq stampi komposti tat-trakea ta 'kull annimal ġew ikkwantifikati bl-użu ta' skript MATLAB awtomatizzat (R2020a, MathWorks) kif deskritt qabel bl-użu ta 'settings ta' 0.35 < lewn < 0.58, saturazzjoni > 0.15 u valur < 0.7 .Billi ssegwi l-kontorni tat-tessuti f'GIMP v2.10.24, inħolqot manwalment maskra għal kull immaġni komposta biex tidentifika ż-żona tat-tessut u tevita kwalunkwe skoperta falza barra t-tessut trakeali.Iż-żoni mtebbgħin mill-immaġini komposti kollha minn kull annimal ġew magħduda biex jagħtu l-erja mtebbgħin totali għal dak l-annimal.Iż-żona miżbugħa mbagħad ġiet diviża bl-erja totali tal-maskra biex tinkiseb żona normalizzata.
Kull trakea kienet inkorporata fil-paraffin u maqsuma 5 µm ħxuna.Is-sezzjonijiet ġew counterstained b'aħmar veloċi newtrali għal 5 minuti u l-immaġini ġew akkwistati bl-użu ta 'mikroskopju Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 u softwer għall-qbid tal-element NIS (verżjoni 5.20.00).
L-analiżi statistiċi kollha saru fi GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Is-sinifikat statistiku ġie stabbilit għal p ≤ 0.05.In-normalità ġiet ittestjata bl-użu tat-test Shapiro-Wilk u d-differenzi fit-tbajja 'LacZ ġew evalwati bl-użu ta' t-test mhux imqabbad.
Is-sitt MPs deskritti fit-Tabella 1 ġew eżaminati minn PCXI, u l-viżibilità hija deskritta fit-Tabella 2. Żewġ MPs tal-polistirene (MP1 u MP2; 18 µm u 0.25 µm, rispettivament) ma kinux viżibbli minn PCXI, iżda l-kampjuni li jifdal setgħu jiġu identifikati (eżempji huma murija fil-Figura 5).MP3 u MP4 huma dgħajjef viżibbli (10-15% Fe3O4; 0.25 µm u 0.9 µm, rispettivament).Għalkemm MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) kien fih xi wħud mill-iżgħar partiċelli ttestjati, kien l-aktar evidenti.Il-prodott CombiMag MP6 huwa diffiċli li ssir distinzjoni.Fil-każijiet kollha, il-kapaċità tagħna li niskopru MFs tjiebet ħafna billi ċċaqlaq il-kalamita 'l quddiem u lura paralleli mal-kapillari.Hekk kif il-kalamiti tbiegħdu mill-kapillari, il-partiċelli nġibdu 'l barra fi ktajjen twal, iżda hekk kif il-kalamiti resqu u s-saħħa tal-kamp manjetiku żdiedet, il-ktajjen tal-partiċelli tqassru hekk kif il-partiċelli emigraw lejn il-wiċċ ta' fuq tal-kapillari (ara Vidjo Supplimentari S1 : MP4), tiżdied id-densità tal-partiċelli fil-wiċċ.Bil-maqlub, meta l-kalamita titneħħa mill-kapillari, is-saħħa tal-kamp tonqos u l-MPs jirranġaw mill-ġdid fi ktajjen twal li jestendu mill-wiċċ ta 'fuq tal-kapillari (ara Vidjo Supplimentari S2: MP4).Wara li l-kalamita tieqaf tiċċaqlaq, il-partiċelli jkomplu jiċċaqilqu għal xi żmien wara li jilħqu l-pożizzjoni tal-ekwilibriju.Hekk kif l-MP jimxi lejn u 'l bogħod mill-wiċċ ta' fuq tal-kapillari, il-partiċelli manjetiċi għandhom it-tendenza li jiġbdu debris permezz tal-likwidu.
Il-viżibilità tal-MP taħt PCXI tvarja konsiderevolment bejn il-kampjuni.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 u (d) MP6.L-immaġini kollha murija hawn ittieħdu b'kalamita pożizzjonata bejn wieħed u ieħor 10 mm direttament 'il fuq mill-kapillari.Iċ-ċrieki kbar apparenti huma bżieżaq tal-arja maqbuda fil-kapillari, li juru b'mod ċar il-karatteristiċi tat-tarf iswed u abjad tal-immaġni tal-kuntrast tal-fażi.Il-kaxxa ħamra tindika l-ingrandiment li jsaħħaħ il-kuntrast.Innota li d-dijametri taċ-ċirkwiti tal-kalamita fil-figuri kollha mhumiex fuq skala u huma madwar 100 darba akbar minn dak muri.
Hekk kif il-kalamita timxi lejn ix-xellug u l-lemin tul in-naħa ta 'fuq tal-kapillari, l-angolu tas-sekwenza MP jinbidel biex jallinja mal-kalamita (ara Figura 6), u b'hekk tiddelinea l-linji tal-kamp manjetiku.Għal MP3-5, wara li l-korda tilħaq l-angolu tal-limitu, il-partiċelli jkaxkru tul il-wiċċ ta 'fuq tal-kapillari.Dan ħafna drabi jirriżulta f'MPs li jingħaqdu fi gruppi akbar qrib fejn il-kamp manjetiku huwa l-aktar b'saħħtu (ara Vidjo Supplimentari S3: MP5).Dan huwa wkoll speċjalment evidenti meta l-immaġini qrib it-tarf tal-kapillari, li jikkawża li l-MP jaggrega u jikkonċentra fl-interface tal-likwidu-arja.Il-partiċelli fl-MP6, li kienu aktar diffiċli biex jiddistingwu minn dawk fl-MP3-5, ma kaxkrux meta l-kalamita mxiet tul il-kapillari, iżda l-kordi MP dissoċjaw, u ħallew il-partiċelli fil-ħsieb (ara Vidjo Supplimentari S4: MP6).F'xi każijiet, meta l-kamp manjetiku applikat kien imnaqqas billi ċċaqlaq il-kalamita distanza twila mis-sit ta 'l-immaġini, kwalunkwe MPs li kien fadal niżel bil-mod sal-wiċċ tal-qiegħ tat-tubu bil-gravità, u baqa' fis-sekwenza (ara Vidjo Supplimentari S5: MP3) .
L-angolu tas-sekwenza MP jinbidel hekk kif il-kalamita timxi lejn il-lemin 'il fuq mill-kapillari.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 u (d) MP6.Il-kaxxa ħamra tindika l-ingrandiment li jsaħħaħ il-kuntrast.Jekk jogħġbok innota li l-vidjows addizzjonali huma għal skopijiet informattivi peress li jiżvelaw struttura ta 'partiċelli importanti u informazzjoni dinamika li ma tistax tiġi viżwalizzata f'dawn l-immaġini statiċi.
It-testijiet tagħna wrew li ċ-ċaqliq tal-kalamita 'l quddiem u lura bil-mod tul it-trakea tiffaċilita l-viżwalizzazzjoni tal-MF fil-kuntest ta' moviment kumpless in vivo.Ma sarux testijiet in vivo minħabba li ż-żibeġ tal-polistirene (MP1 u MP2) ma kinux viżibbli fil-kapillari.Kull wieħed mill-erba' MFs li jifdal ġie ttestjat in vivo bl-assi twil tal-kalamita pożizzjonata fuq it-trakea f'angolu ta 'madwar 30 ° mal-vertikali (ara Figuri 2b u 3a), peress li dan irriżulta f'ktajjen MF itwal u kien aktar effettiv. minn kalamita..konfigurazzjoni mitmuma.MP3, MP4 u MP6 ma nstabux fit-trakea ta 'ebda annimali ħajjin.Meta viżwalizzaw il-passaġġ respiratorju tal-firien wara li qatlu l-annimali b'mod uman, il-partiċelli baqgħu inviżibbli anki meta ġie miżjud volum addizzjonali bl-użu ta 'pompa tas-siringa.MP5 kellu l-ogħla kontenut ta 'ossidu tal-ħadid u kien l-unika partiċella viżibbli, għalhekk intuża biex jevalwa u jikkaratterizza l-imġieba MP in vivo.
It-tqegħid tal-kalamita fuq it-trakea waqt l-inserzjoni ta 'MF irriżulta f'ħafna, iżda mhux kollha, MFs jiġu kkonċentrati fil-kamp ta' vista.Id-dħul trakeali ta' partiċelli jiġi osservat l-aħjar f'annimali ewtanizzati b'mod uman.Figura 7 u Vidjo Supplimentari S6: MP5 juri qbid manjetiku rapidu u allinjament ta 'partiċelli fuq il-wiċċ tat-trakea ventrali, li jindika li MPs jistgħu jkunu mmirati lejn żoni mixtieqa tat-trakea.Meta tfittxija aktar distalment tul it-trakea wara l-kunsinna MF, xi MFs instabu eqreb lejn il-carina, li tindika qawwa tal-kamp manjetiku insuffiċjenti biex jiġbru u jżommu l-MFs kollha, peress li ġew mogħtija permezz tar-reġjun tal-qawwa massima tal-kamp manjetiku matul l-amministrazzjoni tal-fluwidu.proċess.Madankollu, il-konċentrazzjonijiet ta 'MP wara t-twelid kienu ogħla madwar iż-żona tal-immaġni, li jissuġġerixxu li ħafna MPs baqgħu f'reġjuni tal-passaġġi tal-arja fejn is-saħħa tal-kamp manjetiku applikat kienet l-ogħla.
Stampi ta' (a) qabel u (b) wara l-kunsinna ta' MP5 fit-trakea ta' far ewtanizzat reċentement b'kalamita mqiegħda eżatt fuq iż-żona tal-immaġini.Iż-żona murija tinsab bejn żewġ ċrieki kartilaġini.Hemm xi fluwidu fil-passaġġi tan-nifs qabel ma jingħata l-MP.Il-kaxxa ħamra tindika l-ingrandiment li jsaħħaħ il-kuntrast.Dawn l-immaġini huma meħuda mill-video dehru f'S6: Video Supplimentari MP5.
Iċ-ċaqliq tal-kalamita tul it-trakea in vivo rriżulta f'bidla fl-angolu tal-katina MP fuq il-wiċċ tal-passaġġ tan-nifs, simili għal dak osservat fil-kapillari (ara Figura 8 u Vidjo Supplimentari S7: MP5).Madankollu, fl-istudju tagħna, MPs ma setgħux jiġu mkaxkra tul il-wiċċ tal-passaġġi respiratorji ħajjin, kif jistgħu jagħmlu l-kapillari.F'xi każijiet, il-katina MP tittawwal hekk kif il-kalamita timxi lejn ix-xellug u l-lemin.Interessanti, sibna wkoll li l-katina tal-partiċelli tbiddel il-fond tas-saff tal-wiċċ tal-fluwidu meta l-kalamita titmexxa b'mod lonġitudinali tul it-trakea, u tespandi meta l-kalamita titmexxa direttament 'l fuq u l-katina tal-partiċelli tiddawwar għal pożizzjoni vertikali (ara Vidjo Supplimentari S7).: MP5 f'0:09, qiegħ il-lemin).Il-mudell tal-moviment karatteristiku nbidel meta l-kalamita ġiet imċaqalqa lateralment fuq in-naħa ta 'fuq tat-trakea (jiġifieri, lejn ix-xellug jew il-lemin tal-annimal, aktar milli tul it-tul tat-trakea).Il-partiċelli kienu għadhom viżibbli b'mod ċar waqt il-moviment tagħhom, iżda meta l-kalamita tneħħiet mit-trakea, it-truf tal-kordi tal-partiċelli saru viżibbli (ara Vidjo Supplimentari S8: MP5, li jibda f'0:08).Dan jaqbel mal-imġieba osservata tal-kamp manjetiku taħt l-azzjoni ta 'kamp manjetiku applikat f'kapillari tal-ħġieġ.
Stampi ta’ kampjun li juru MP5 fit-trakea ta’ far anestetizzat ħaj.(a) Il-kalamita tintuża biex takkwista immaġini fuq u fuq ix-xellug tat-trakea, imbagħad (b) wara li tmexxi l-kalamita lejn il-lemin.Il-kaxxa ħamra tindika l-ingrandiment li jsaħħaħ il-kuntrast.Dawn l-immaġini huma mill-video li jidher fil-Vidjo Supplimentari ta' S7: MP5.
Meta ż-żewġ arbli ġew sintonizzati f'orjentazzjoni tat-trachea 'l fuq u taħt it-trakea (jiġifieri, jattiraw; Fig. 3b), il-kordi MP dehru itwal u kienu jinsabu fuq il-ħajt laterali tat-trakea aktar milli fuq il-wiċċ dorsali tal- trakea (ara l-Appendiċi).Vidjo S9:MP5).Madankollu, konċentrazzjonijiet għoljin ta 'partiċelli f'sit wieħed (jiġifieri, il-wiċċ dorsali tat-trakea) ma ġewx skoperti wara amministrazzjoni ta' fluwidu bl-użu ta 'apparat ta' kalamita doppja, li normalment iseħħ b'apparat ta 'kalamita waħda.Imbagħad, meta kalamita waħda ġiet ikkonfigurata biex tirrepeli l-arbli opposti (Figura 3c), in-numru ta 'partiċelli viżibbli fil-kamp viżiv ma żdiedx wara l-kunsinna.It-twaqqif taż-żewġ konfigurazzjonijiet ta 'kalamita huwa ta' sfida minħabba s-saħħa għolja tal-kamp manjetiku li tattira jew timbotta l-kalamiti rispettivament.Is-setup imbagħad inbidel għal kalamita waħda parallela mal-passaġġi tan-nifs iżda li tgħaddi mill-passaġġi tan-nifs f'angolu ta '90 grad sabiex il-linji tal-forza qasmu l-ħajt trakeali ortogonalment (Figura 3d), orjentazzjoni maħsuba biex tiddetermina l-possibbiltà ta' aggregazzjoni ta 'partikuli fuq il-ħajt laterali.jiġu osservati.Madankollu, f'din il-konfigurazzjoni, ma kien hemm l-ebda moviment ta 'akkumulazzjoni MF identifikabbli jew moviment tal-kalamita.Ibbażat fuq dawn ir-riżultati kollha, intgħażlet konfigurazzjoni b'kalamita waħda u orjentazzjoni ta '30 grad għal studji in vivo ta' trasportaturi tal-ġeni (Fig. 3a).
Meta l-annimal kien immaġinat bosta drabi immedjatament wara li ġie sagrifikat b'mod uman, in-nuqqas ta 'moviment tat-tessuti li jinterferixxi fisser li linji ta' partiċelli ifjen u iqsar setgħu jintgħarfu fil-qasam interkartilaġinuż ċar, 'jitbandal' skond il-moviment ta 'translazzjoni tal-kalamita.ara b'mod ċar il-preżenza u l-moviment tal-partiċelli MP6.
It-titru ta' LV-LacZ kien 1.8 x 108 IU/mL, u wara li tħallat 1:1 ma' CombiMag MP (MP6), l-annimali ġew injettati b'50 µl ta' doża trakeali ta' 9 x 107 IU/ml ta' vettura LV (jiġifieri 4.5 x 106 TU/far).).).F'dawn l-istudji, minflok ma nċaqalqu l-kalamita waqt ix-xogħol, iffissajna l-kalamita f'pożizzjoni waħda biex niddeterminaw jekk it-trasduzzjoni tal-LV setgħetx (a) tittejjeb meta mqabbel mal-kunsinna tal-vettur fin-nuqqas ta 'kamp manjetiku, u (b) jekk il-passaġġ tal-arja setgħetx. tkun iffukata.Iċ-ċelloli li qed jiġu trasdotti fiż-żoni fil-mira manjetiċi tal-passaġġ respiratorju ta 'fuq.
Il-preżenza ta 'kalamiti u l-użu ta' CombiMag flimkien ma 'vettori LV ma dehrux li jaffettwaw ħażin is-saħħa tal-annimali, kif għamel il-protokoll standard tagħna ta' kunsinna ta 'vettur LV.Immaġini ta 'quddiem tar-reġjun trakeali soġġetti għal perturbazzjoni mekkanika (Fig. 1 Supplimentari) urew li l-grupp trattat LV-MP kellu livelli ogħla b'mod sinifikanti ta' transduzzjoni fil-preżenza ta 'kalamita (Fig. 9a).Ammont żgħir biss ta 'tbajja' blu ta' LacZ kien preżenti fil-grupp ta 'kontroll (Figura 9b).Il-kwantifikazzjoni ta 'reġjuni normalizzati mtebbgħin X-Gal uriet li l-amministrazzjoni ta' LV-MP fil-preżenza ta 'kamp manjetiku rriżultat f'titjib ta' madwar 6 darbiet (Fig. 9c).
Eżempju ta 'immaġini komposti li juru transduzzjoni trakeali b'LV-MP (a) fil-preżenza ta' kamp manjetiku u (b) fin-nuqqas ta 'kalamita.(c) Titjib statistikament sinifikanti fiż-żona normalizzata tat-trasduzzjoni LacZ fit-trakea bl-użu ta 'kalamita (*p = 0.029, t-test, n = 3 għal kull grupp, medja ± żball standard tal-medja).
Sezzjonijiet newtrali mtebbgħin bl-aħmar veloċi (eżempju muri f'Fig. 2 Supplimentari) indikaw li ċ-ċelloli mtebbgħin b'LacZ kienu preżenti fl-istess kampjun u fl-istess post kif irrappurtat qabel.
L-isfida ewlenija fit-terapija tal-ġeni tal-passaġġi tal-arja tibqa 'l-lokalizzazzjoni preċiża tal-partiċelli tal-ġarr f'żoni ta' interess u l-kisba ta 'livell għoli ta' effiċjenza tat-trasduzzjoni fil-pulmun mobbli fil-preżenza ta 'fluss tal-arja u tneħħija attiva tal-mukus.Għal trasportaturi LV maħsuba għat-trattament ta 'mard respiratorju fil-fibrożi ċistika, iż-żieda tal-ħin ta' residenza tal-partiċelli ta 'ġarr fil-passaġġi tan-nifs konduttivi s'issa kienet għan li ma jintlaħaqx.Kif indikat minn Castellani et al., L-użu ta 'kampijiet manjetiċi biex itejbu t-trasduzzjoni għandu vantaġġi fuq metodi oħra ta' twassil tal-ġeni bħall-elettroporazzjoni minħabba li jista 'jgħaqqad is-sempliċità, l-ekonomija, il-kunsinna lokalizzata, iż-żieda fl-effiċjenza u l-ħin ta' inkubazzjoni iqsar.u possibbilment doża aktar baxxa ta' vettura10.Madankollu, id-depożizzjoni in vivo u l-imġieba ta 'partiċelli manjetiċi fil-passaġġi tan-nifs taħt l-influwenza ta' forzi manjetiċi esterni qatt ma ġew deskritti, u fil-fatt l-abbiltà ta 'dan il-metodu li jżid il-livelli ta' espressjoni tal-ġeni fil-passaġġi tan-nifs ħajjin intatti ma ntwerietx in vivo.
L-esperimenti in vitro tagħna fuq is-sinkrotron PCXI urew li l-partiċelli kollha li ttestjajna, bl-eċċezzjoni tal-polistirene MP, kienu viżibbli fis-setup tal-immaġini li użajna.Fil-preżenza ta 'kamp manjetiku, kampi manjetiċi jiffurmaw kordi, li t-tul tagħhom huwa relatat mat-tip ta' partiċelli u s-saħħa tal-kamp manjetiku (jiġifieri, il-prossimità u l-moviment tal-kalamita).Kif muri fil-Figura 10, il-kordi li nosservaw huma ffurmati hekk kif kull partiċella individwali ssir manjetizzata u tinduċi l-kamp manjetiku lokali tagħha stess.Dawn l-oqsma separati jikkawżaw partiċelli simili oħra biex jiġbru u jgħaqqdu ma 'movimenti ta' spag tal-grupp minħabba forzi lokali mill-forzi lokali ta 'attrazzjoni u repulsjoni ta' partiċelli oħra.
Dijagramma li turi (a, b) ktajjen ta' partiċelli li jiffurmaw ġewwa kapillari mimlija fluwidu u (ċ, d) trakea mimlija bl-arja.Innota li l-kapillari u t-trakea mhumiex miġbuda fuq skala.Il-pannell (a) fih ukoll deskrizzjoni tal-MF li fih partiċelli Fe3O4 rranġati fi ktajjen.
Meta l-kalamita mċaqalqa fuq il-kapillari, l-angolu tas-sekwenza tal-partiċelli laħaq il-limitu kritiku għal MP3-5 li fih Fe3O4, wara li l-sekwenza tal-partiċelli m'għadhiex baqgħet fil-pożizzjoni oriġinali tagħha, iżda mxiet tul il-wiċċ għal pożizzjoni ġdida.kalamita.Dan l-effett x'aktarx iseħħ minħabba li l-wiċċ tal-kapillari tal-ħġieġ huwa lixx biżżejjed biex jippermetti li jseħħ dan il-moviment.Interessanti, MP6 (CombiMag) ma ġabx ruħu b'dan il-mod, forsi minħabba li l-partiċelli kienu iżgħar, kellhom kisi jew ħlas tal-wiċċ differenti, jew il-fluwidu tal-ġarr proprjetarju affettwa l-kapaċità tagħhom li jiċċaqilqu.Il-kuntrast fl-immaġni tal-partiċelli CombiMag huwa wkoll aktar dgħajjef, u jissuġġerixxi li l-likwidu u l-partiċelli jista 'jkollhom l-istess densità u għalhekk ma jistgħux jimxu faċilment lejn xulxin.Partiċelli jistgħu wkoll jeħlu jekk il-kalamita timxi malajr wisq, li jindika li s-saħħa tal-kamp manjetiku ma tistax dejjem tegħleb il-frizzjoni bejn il-partiċelli fil-fluwidu, li tissuġġerixxi li s-saħħa tal-kamp manjetiku u d-distanza bejn il-kalamita u ż-żona fil-mira m'għandhomx jiġu bħala a sorpriża.importanti.Dawn ir-riżultati jindikaw ukoll li għalkemm il-kalamiti jistgħu jaqbdu ħafna mikropartiċelli li jgħaddu miż-żona fil-mira, huwa improbabbli li l-kalamiti jistgħu jiġu bbażati fuqhom biex iċċaqilqu partiċelli CombiMag tul il-wiċċ tat-trakea.Għalhekk, aħna kkonkludejna li studji LV MF in vivo għandhom jużaw kampi manjetiċi statiċi biex jimmiraw fiżikament żoni speċifiċi tas-siġra tal-passaġġ tan-nifs.
Ladarba l-partiċelli jitwasslu fil-ġisem, huma diffiċli biex jiġu identifikati fil-kuntest tat-tessut kumpless li jiċċaqlaq tal-ġisem, iżda l-kapaċità ta 'skoperta tagħhom ġiet imtejba billi l-kalamita titmexxa orizzontalment fuq it-trakea biex "jiċċaqlaq" il-kordi MP.Filwaqt li l-immaġini f'ħin reali hija possibbli, huwa aktar faċli li wieħed jagħraf il-moviment tal-partiċelli wara li l-annimal ikun inqatel b'mod uman.Il-konċentrazzjonijiet tal-MP kienu ġeneralment l-ogħla f'dan il-post meta l-kalamita kienet pożizzjonata fuq iż-żona tal-immaġini, għalkemm xi partiċelli ġeneralment instabu aktar 'l isfel fit-trakea.B'differenza mill-istudji in vitro, il-partiċelli ma jistgħux jiġu mkaxkra fit-trakea permezz tal-moviment ta 'kalamita.Din is-sejba hija konsistenti ma 'kif il-mukus li jkopri l-wiċċ tat-trakea tipikament jipproċessa partiċelli li jinġibdu man-nifs, jaqbadhom fil-mukus u sussegwentement ineħħihom permezz tal-mekkaniżmu ta' tneħħija muko-ċiljari.
Aħna ipoteżijna li l-użu ta 'kalamiti fuq u taħt it-trakea għall-attrazzjoni (Fig. 3b) jista' jirriżulta f'kamp manjetiku aktar uniformi, aktar milli kamp manjetiku li huwa kkonċentrat ħafna f'punt wieħed, li potenzjalment jirriżulta f'distribuzzjoni aktar uniformi ta 'partiċelli..Madankollu, l-istudju preliminari tagħna ma sabx evidenza ċara li tappoġġja din l-ipoteżi.Bl-istess mod, l-issettjar ta 'par ta' kalamiti biex tirreġġa' lura (Fig. 3c) ma rriżultatx f'aktar partiċelli li jissetiljaw fiż-żona tal-immaġni.Dawn iż-żewġ sejbiet juru li s-setup b'kalamita doppja ma ttejjebx b'mod sinifikanti l-kontroll lokali tal-ippuntar MP, u li l-forzi manjetiċi qawwija li jirriżultaw huma diffiċli biex jiġu rranġati, u jagħmlu dan l-approċċ inqas prattiku.Bl-istess mod, l-orjentament tal-kalamita 'l fuq u madwar it-trakea (Figura 3d) ukoll ma żiedx in-numru ta' partiċelli li fadal fiż-żona tal-immaġini.Xi wħud minn dawn il-konfigurazzjonijiet alternattivi jistgħu ma jirnexxux peress li jirriżultaw fi tnaqqis fil-qawwa tal-kamp manjetiku fiż-żona ta 'depożizzjoni.Għalhekk, il-konfigurazzjoni ta 'kalamita waħda fi 30 grad (Fig. 3a) hija meqjusa bħala l-aktar metodu ta' ttestjar in vivo sempliċi u effiċjenti.
L-istudju LV-MP wera li meta l-vettori LV ġew ikkombinati ma 'CombiMag u mogħtija wara li ġew disturbati fiżikament fil-preżenza ta' kamp manjetiku, il-livelli ta 'transduzzjoni żdiedu b'mod sinifikanti fit-trakea meta mqabbla mal-kontrolli.Ibbażat fuq studji ta 'l-immaġini ta' synchrotron u riżultati LacZ, il-kamp manjetiku deher li kien kapaċi jżomm l-LV fit-trakea u jnaqqas in-numru ta 'partiċelli tal-vettur li immedjatament ippenetraw fil-fond fil-pulmun.Tali titjib fil-mira jista’ jwassal għal effiċjenza ogħla filwaqt li jnaqqas it-titri mogħtija, it-trasduzzjoni mhux immirata, l-effetti sekondarji infjammatorji u immuni, u l-ispejjeż tat-trasferiment tal-ġeni.Importanti, skond il-manifattur, CombiMag jista 'jintuża flimkien ma' metodi oħra ta 'trasferiment tal-ġeni, inklużi vettori virali oħra (bħal AAV) u aċidi nuklejċi.